脊髓缺血再灌注損傷的microRNA調(diào)節(jié)機(jī)制探討.pdf

1、背景：
　　脊髓缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，I/R injury）是一種常見(jiàn)的臨床病理生理過(guò)程，無(wú)論是在脊髓本身的創(chuàng)傷還是在心胸外科、血管外科、脊柱外科等領(lǐng)域的醫(yī)源性損傷或手術(shù)并發(fā)癥中，I/R都扮演著非常重要的角色。脊髓I/R損傷可造成嚴(yán)重后果，并且目前的治療效果欠佳。尋找新的預(yù)防和治療脊髓I/R損傷的方法至關(guān)重要。對(duì)脊髓I/R損傷的機(jī)制探討的缺乏是探索新防治方法的障礙之一。因此，進(jìn)一步

2、深入研究脊髓I/R損傷的機(jī)制有助于開(kāi)拓新的研究思路。
　　微小RNA（microRNA，miRNA）是近年發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)長(zhǎng)度約為20-24個(gè)核苷酸的非編碼的核糖核酸(RNA)分子，能抑制信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)的翻譯從而調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)。目前，已在哺乳動(dòng)物的包括腦和脊髓在內(nèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中發(fā)現(xiàn)多種miRNA的表達(dá)，這些miRN

3、A參與了多種中樞神經(jīng)創(chuàng)傷或變性疾病的病理生理過(guò)程。但是，尚不清楚miRNA在脊髓I/R損傷過(guò)程中是否發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。他汀類(lèi)藥物對(duì)I/R損傷的保護(hù)作用已在脊髓、大腦、心臟、肺、肝臟、腎臟和腸等諸多組織器官中得到證實(shí)。但是，他汀類(lèi)藥物對(duì)促進(jìn)脊髓I/R損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的確切機(jī)制卻鮮有報(bào)道，他汀類(lèi)藥物是否通過(guò)調(diào)控miRNA而發(fā)揮在脊髓I/R損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用是值得我們進(jìn)一步探討的。
　　目的：
　　本研究旨在通過(guò)miRNA

4、芯片技術(shù)探討miRNA在脊髓I/R損傷大鼠模型中的表達(dá)及阿托伐他汀預(yù)處理對(duì)miRNA表達(dá)的影響，篩選差異表達(dá)的miRNA，從而進(jìn)一步在細(xì)胞模型中進(jìn)行驗(yàn)證，并深入探討miRNA調(diào)節(jié)脊髓I/R損傷的確切機(jī)制。
　　方法：
　　一.大鼠脊髓缺血再灌注損傷后microRNA表達(dá)改變及阿托伐他汀的干預(yù)作用探討
　　以阻斷SD大鼠腹主動(dòng)脈的方法建立大鼠脊髓I/R損傷的模型，18只大鼠分為三組，分別為:假手術(shù)組、手術(shù)組（只接受生理鹽

5、水）和藥物組（阿托伐他汀10mg/kg/d預(yù)處理2周）。分別在再灌注6、12、24和48小時(shí)應(yīng)用Basso Beattie Bresnahan(BBB)評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)脊髓神經(jīng)功能;采用hematoxylin-eosin(HE)染色，2，3，5，-triphenyltetrazoliumchloride(TTC)染色明確神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化及損傷情況;miRNA芯片檢測(cè)缺血再灌注脊髓組織miRNA表達(dá)譜;采用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。
　　

6、二.缺血缺氧再灌注對(duì)PC12細(xì)胞miR-146a表達(dá)的影響
　　以氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧復(fù)糖的方法建立PC12細(xì)胞I/R損傷模型，血?dú)夥治鰞x檢測(cè)培養(yǎng)液pO2以評(píng)估缺氧系統(tǒng)效果;采用實(shí)時(shí)定量PCR方法分別檢測(cè)對(duì)照組和缺血再灌注組（I/R組）白細(xì)胞介素1受體關(guān)聯(lián)激酶1（IRAK1）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達(dá);分別在細(xì)胞缺血缺氧再灌注后0、24、48和72小時(shí)采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖;并分別在6、12和24小時(shí)檢測(cè)miR-146a和mi

7、R-199a的表達(dá)。
　　三.miR-146a調(diào)控PC12細(xì)胞缺血缺氧再灌注的機(jī)制探討
　　采用氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧復(fù)糖的方法建立PC12細(xì)胞I/R損傷模型;轉(zhuǎn)染miR-146a互補(bǔ)單鏈（抑制物）或miR-146a雙鏈（模擬物，是一種增效劑），抑制或過(guò)度表達(dá)PC12細(xì)胞miR-146a的表達(dá)水平;分別在細(xì)胞缺血再灌注后0、24、48和72小時(shí)采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖;采用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)SIKE1為miR-146a的靶基因，構(gòu)

8、建用于鑒定靶基因的報(bào)告基因載體，并與miR-146a模擬物共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，檢測(cè)報(bào)告基因中海腎熒光素酶相對(duì)活性;采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IRAK1、IKKε抑制因子(SIKE1) mRNA的表達(dá);采用western blot檢測(cè)IκB-α和磷酸化IκB-α的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　一.大鼠脊髓缺血再灌注損傷后microRNA表達(dá)改變及阿托伐他汀的干預(yù)作用探討
　　手術(shù)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的BBB評(píng)分較假手術(shù)組顯著下降，阿托伐

9、他汀預(yù)處理后，在再灌注6、12、24、和48小時(shí)后BBB評(píng)分均較手術(shù)組明顯改善;手術(shù)后48小時(shí)對(duì)缺血再灌注脊髓組織行TTC染色，對(duì)缺血面積行定量檢測(cè)，手術(shù)組缺血面積顯著大于假手術(shù)組(2.1±0.1.vs.77.3±5.1，P＜0.01)，阿托伐他汀干預(yù)后，與手術(shù)組相比，缺血面積顯著縮小(43±3.2.vs.77.3±5.1，P＜0.05)。在缺血再灌注48小時(shí)后采用芯片檢測(cè)miRNA表達(dá)譜的改變。與假手術(shù)組相比，其中48種miRNA在缺

10、血再灌注后表達(dá)明顯改變，38種上調(diào)1.6-4.9倍，另有10個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。采用10mg/kg/d的阿托伐他汀預(yù)處理后，與手術(shù)組相比，13種miRNA表達(dá)發(fā)生改變。其中，阿托伐他汀預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)缺血再灌注損傷后的8種miRNA，包括miR-365、miR-323、miR-672*、miR-760-5p、miR-376b-5p、miR-369-5p、miR-210和miR-199a。
　　二.缺血缺氧再灌注對(duì)PC12細(xì)胞miR-

11、146a表達(dá)的影響
　　1.經(jīng)血?dú)夥治鰞x檢測(cè)未缺氧的細(xì)胞培養(yǎng)液中的pO2為87.36±2.58mmHg，而缺氧24小時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)液中的pO2為37.63±0.78mmHg，與未缺氧的細(xì)胞培養(yǎng)液相比，pO2下降約56.9％;
　　2.PC12細(xì)胞經(jīng)缺血再灌注處理24小時(shí)后，可觀察到IRAK1mRNA表達(dá)明顯升高，為對(duì)照組的3.95±0.25倍;同樣，TNF-α mRNA表達(dá)明顯升高，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);<

12、br>　　3.分別在細(xì)胞缺血再灌注后0、24、48和72小時(shí)采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，對(duì)照組和I/R組在24小時(shí)細(xì)胞增殖最明顯，同時(shí)，缺血再灌注可使細(xì)胞增殖受到明顯抑制，在24、48和72小時(shí)分別下降17.8％、15.5％和12.9％;
　　4.缺血再灌注損傷對(duì)miR-199a的表達(dá)無(wú)影響，相反，與對(duì)照組相比，miR-146a的表達(dá)顯著升高，且與缺血缺氧的時(shí)間成正相關(guān)，缺血24小時(shí)組miR-146a的表達(dá)升高最為明顯，為對(duì)照組的9

13、倍。
　　三.miR-146a調(diào)控PC12細(xì)胞缺血缺氧再灌注的機(jī)制探討
　　1.轉(zhuǎn)染抑制物后，可見(jiàn)miR-146a表達(dá)在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)明顯下降，分別為對(duì)照組的0.17±0.03、0.16±0.01倍(P值均＜0.001);在轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物后，可見(jiàn)miR-146a表達(dá)在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)明顯升高，分別為對(duì)照組的26.1±3.01、26.5±3.02倍（P值均＜0.001）;
　　2.與陰性對(duì)照

14、組相比，轉(zhuǎn)染miR-146a抑制物后，IRAK1的表達(dá)明顯升高，而轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物后，IRAK1的表達(dá)被抑制，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;
　　3.轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物后，磷酸化IκB-α的表達(dá)明顯降低53％，而轉(zhuǎn)染miR-146a抑制物后，磷酸化IκB-α的表達(dá)明顯升高達(dá)3.12±0.25倍;
　　4.轉(zhuǎn)染miR-146a抑制物后，與陰性對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖被抑制，分別在24小時(shí)和72小時(shí)最明顯。轉(zhuǎn)染m

15、iR-146a模擬物使miR-146a過(guò)表達(dá)后，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，在24小時(shí)最明顯;
　　5.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示miR-146a能顯著抑制含3'-UTR的SIKE1報(bào)告基因活性(P＜0.05)，而對(duì)含3'-UTR突變位點(diǎn)的SIKE1報(bào)告基因載體無(wú)抑制;
　　6.與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-146a抑制物后，SIKE1的表達(dá)明顯升高，而轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物后，SIKE1的表達(dá)被抑制，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。<

16、br>　　結(jié)論：
　　1.miRNA參與了對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷的調(diào)節(jié)，阿托伐他汀預(yù)處理可對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其對(duì)miRNA的調(diào)控有關(guān);
　　2.在PC12細(xì)胞缺血再灌注損傷模型中，miR-146a的表達(dá)升高，且其程度與缺氧時(shí)間相關(guān)，在24小時(shí)表達(dá)呈高峰，提示miR-146a參與了PC12細(xì)胞缺血再灌注損傷的調(diào)控，但其具體的機(jī)制尚值得進(jìn)一步的探討;
　　3.miR-146a可通過(guò)抑制