缺血再灌注致脊髓神經(jīng)元損傷特點(diǎn)及其致癱機(jī)制研究.pdf

1、脊髓損傷（Spinal cord injury,SCI）后運(yùn)動(dòng)功能損害與康復(fù)是當(dāng)今廣大神經(jīng)科學(xué)研究者亟待解決的重大課題之一。脊髓是軀體和四肢反射活動(dòng)的低級(jí)中樞，它通過接受神經(jīng)通路的上行、下行信息并予以整合、編碼，以及神經(jīng)元之間的突觸、纖維聯(lián)系及神經(jīng)遞質(zhì)的相互作用而完成運(yùn)動(dòng)和姿勢(shì)的維持。因此，脊髓損傷所致截癱與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元對(duì)傳入、傳出信息的加工、處理、編碼及整合作用異常直接相關(guān)。雖然目前有諸如手術(shù)、細(xì)胞移植和電子工程等策略來幫助脊髓損傷截癱

2、患者恢復(fù)運(yùn)動(dòng)功能，但總體而言其療效甚微。這可能與目前我們對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在脊髓損傷后，信息編碼的變化規(guī)律及其反饋調(diào)控機(jī)制改變?nèi)狈α私庥嘘P(guān)。
　　研究表明，脊髓損傷后的病理改變特征是“急性、進(jìn)行性、中央型變性壞死”，這提示脊髓損傷后灰質(zhì)的損傷早于白質(zhì)。而灰質(zhì)是神經(jīng)元所在區(qū)域，那么不同類型神經(jīng)元對(duì)損傷因素的反應(yīng)是否具有差異，目前尚不十分清楚。神經(jīng)元根據(jù)功能可分為感覺神經(jīng)元、中間神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，其中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和中間神經(jīng)元與脊髓運(yùn)動(dòng)功能直

3、接關(guān)聯(lián)。脊髓作為初級(jí)運(yùn)動(dòng)中樞，在接受了高級(jí)中樞發(fā)出的運(yùn)動(dòng)指令后，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元會(huì)產(chǎn)生動(dòng)作電位，將運(yùn)動(dòng)指令以電信息編碼的方式傳遞給下行通路，同時(shí)在該過程中釋放神經(jīng)遞質(zhì)，傳遞化學(xué)信息。為保證運(yùn)動(dòng)指令執(zhí)行的準(zhǔn)確和適度性，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的活動(dòng)要受到中間神經(jīng)元的調(diào)控，其中脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異性地接受一種特殊類型中間神經(jīng)元閏紹細(xì)胞(Renshaw cell，RC)的抑制性輸入，形成回返抑制通路。當(dāng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元興奮時(shí)，傳出沖動(dòng)沿其軸突外傳，同時(shí)又經(jīng)軸突側(cè)支興奮閏

4、紹細(xì)胞，閏紹細(xì)胞則反過來抑制運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，從而使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元不會(huì)無限制地興奮。如果閏紹細(xì)胞和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元對(duì)損傷因素易感性有差異，那么閏紹細(xì)胞和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的電活動(dòng)會(huì)發(fā)生什么樣的改變，尤其當(dāng)閏紹細(xì)胞功能受損時(shí)是否會(huì)影響其對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的抑制作用，使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元處于“去抑制”狀態(tài)，從而造成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元放電特征及其整合功能的改變，目前尚不清楚。
　　既往關(guān)于脊髓神經(jīng)元電活動(dòng)的研究，主要是通過在體實(shí)驗(yàn)和膜片鉗技術(shù)研究在生理?xiàng)l件下神經(jīng)元的電活動(dòng)，僅有少部

5、分研究者觀察了脊髓損傷模型中神經(jīng)元電活動(dòng)。有研究者觀察了光化學(xué)致脊髓短暫性缺血時(shí)（幾分鐘）或半切損傷時(shí)背角神經(jīng)元的電活動(dòng)的改變，以及大鼠尾部缺血再灌注對(duì)脊髓背角會(huì)聚性神經(jīng)元高興奮性及機(jī)械超敏感性的影響，這些研究均未反應(yīng)脊髓損傷過程中，不同種類神經(jīng)元電活動(dòng)的變化及其相互作用關(guān)系。因此，利用動(dòng)物脊髓損傷模型在體動(dòng)態(tài)記錄閏紹細(xì)胞和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在損傷過程中電活動(dòng)的變化，以及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元整合功能的改變，明確閏紹細(xì)胞和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在損傷條件下的差異性表現(xiàn)

6、，對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)脊髓損傷后機(jī)體功能障礙的電生理機(jī)制具有重要意義。
　　神經(jīng)遞質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中發(fā)揮著重要作用，回返抑制通路中閏紹細(xì)胞是釋放抑制性遞質(zhì)甘氨酸(glycin，Gly)超級(jí)化運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，抑制運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元興奮的發(fā)放。在既往的興奮毒性學(xué)說主要關(guān)注的是谷氨酸及其受體，而對(duì)于抑制性遞質(zhì)的關(guān)注相對(duì)較少。近年來關(guān)于抑制性遞質(zhì)γ-氨基丁酸(aminobutyric acid，GABA)的在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用也存在爭(zhēng)議;Gly及其

7、受體的作用既往研究主要集中在脊髓病理性疼痛模型中，而在脊髓損傷過程中作為閏紹細(xì)胞和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元間的特異性抑制遞質(zhì)，Gly及其受體如何變化，是否與其他遞質(zhì)一起參與了神經(jīng)元興奮毒性損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)元進(jìn)入鈣超載這個(gè)公共死亡通路，目前仍不十分清楚。
　　脊髓缺血再灌注損傷模型，由于在造模過程中保持了脊髓組織結(jié)構(gòu)的完整性，有利于在體記錄神經(jīng)元損傷過程中電生理活動(dòng)的變化，為此，本課題研究首先建立經(jīng)典的家兔脊髓缺血再灌注模型，利用神經(jīng)病理、免疫

8、組化和神經(jīng)電生理學(xué)及分子生物學(xué)等技術(shù)方法，觀察脊髓缺血及再灌注過程中神經(jīng)元形態(tài)和電生理活動(dòng)的變化，并進(jìn)一步探討相應(yīng)神經(jīng)遞質(zhì)及其受體和胞內(nèi)鈣離子的變化規(guī)律，以揭示脊髓缺血再灌注損傷過程中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和中間神經(jīng)元的損傷特點(diǎn)及其致癱的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。
　　方法：
　　1.構(gòu)建腰動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈阻斷法兩種經(jīng)典的脊髓缺血再灌注損傷模型，通過神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)篩選出適合本實(shí)驗(yàn)的損傷模型。
　　2.在篩選模型基礎(chǔ)上利用神經(jīng)功能評(píng)估技術(shù)，在缺

9、血30min、60min和90min條件下不同再灌注時(shí)間的家兔截癱發(fā)生情況進(jìn)行比較分析，確定適合后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的缺血再灌注損傷時(shí)間。
　　3.通過HE、Nissl染色觀察缺血再灌注損傷脊髓不同部位組織結(jié)構(gòu)的病理損傷特點(diǎn);進(jìn)一步通過免疫熒光染色觀察不同種類神經(jīng)元的損傷情況。
　　4.利用單位放電記錄技術(shù)，在體記錄脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和中間神經(jīng)元在正常、缺血和再灌注過程中放電活動(dòng)的動(dòng)態(tài)變化，并通過NeuroExplorer5.0軟件對(duì)神

10、經(jīng)元放電活動(dòng)的變化規(guī)律進(jìn)行時(shí)頻分析。
　　5.利用ELISA和Western-blot方法，檢測(cè)脊髓缺血再灌注過程中神經(jīng)遞質(zhì)及其受體蛋白的變化，并通過實(shí)時(shí)免疫熒光定量檢測(cè)該過程中神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度以及相關(guān)鈣蛋白的改變。
　　結(jié)果：
　　1.通過比較家兔腰動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈阻斷法建立的脊髓缺血再灌注損傷模型，提示腹主動(dòng)脈阻斷模型具有致癱率高、易操作和重復(fù)性好的特點(diǎn)，更適合本實(shí)驗(yàn)研究。
　　2.在家兔腹主動(dòng)脈阻斷模型中

11、，缺血30min、60min和90min能分別復(fù)制出脊髓輕度、中重度和極重度損傷;截癱嚴(yán)重程度與脊髓缺血時(shí)間密切相關(guān):缺血少于30min，再灌注損傷可逆;大于30min時(shí)隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)脊髓功能損害逐漸加重、損傷不可逆，缺血90min損傷最嚴(yán)重、死亡率高。其中缺血60min致癱率高、死亡率低，是研究脊髓缺血再灌注致癱的理想時(shí)間。
　　3.家兔脊髓缺血再灌注損傷后，后肢多表現(xiàn)為肌張力增高、牽張反射亢進(jìn)、呈強(qiáng)直狀態(tài)，為痙攣性癱瘓。<

12、br>　　4.缺血再灌注導(dǎo)致的脊髓損傷，灰質(zhì)病理損害較白質(zhì)明顯;神經(jīng)元尼氏小體崩解、核固縮、細(xì)胞形態(tài)消失以至死亡。脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和中間神經(jīng)元死亡率較接近，但中間神經(jīng)元死亡數(shù)量相對(duì)更多。
　　5.缺血和再灌注過程中，脊髓神經(jīng)元早期主要表現(xiàn)為放電活動(dòng)加強(qiáng)、后期放電逐漸減少;對(duì)內(nèi)臟大神經(jīng)和腓神經(jīng)電刺激及同時(shí)刺激均出現(xiàn)興奮、抑制和無反應(yīng)三種改變，但對(duì)同時(shí)刺激無反應(yīng)的神經(jīng)元明顯增加。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元早期的放電常表現(xiàn)為震蕩式的波動(dòng)性增加，而中間神經(jīng)

13、元（閏紹細(xì)胞）則為持續(xù)高頻爆發(fā)式發(fā)放，閏紹細(xì)胞對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元放電有較明顯的抑制作用。信息編碼分析觀察到:放電頻率增加的神經(jīng)元還表現(xiàn)出ISI明顯縮短且分布更集中、更規(guī)則。
　　6.脊髓缺血再灌注損傷后，CSEP和MEP的N1波峰潛時(shí)延長(zhǎng)，波幅降低。
　　7.缺血再灌注損傷過程中，EAA/IAA比例失調(diào):其中興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu升高，其與鈣離子活動(dòng)相關(guān)受體NR1表達(dá)也隨之升高;抑制性遞質(zhì)Gly和GABA降低，相應(yīng)受體的表達(dá)代償性增

14、加。Gly降低于再灌注后10min即可出現(xiàn)，而GABA的降低則主要發(fā)生在再灌注損傷72h后。
　　8.神經(jīng)元胞體內(nèi)鈣離子濃度在損傷后顯著增高，胞內(nèi)鈣蛋白酶CalpainⅠ表達(dá)也相應(yīng)增高，同時(shí)觀察到CalpainⅠ特異性降解底物68-KDNFP濃度降低。
　　結(jié)論：
　　1.腹主動(dòng)脈阻斷法所致脊髓缺血再灌注損傷“窗口期”為缺血30min，所導(dǎo)致的后肢功能障礙主要表現(xiàn)為痙攣性癱瘓。
　　2.脊髓組織細(xì)胞對(duì)缺血再灌注損

15、傷存在較明顯的易感性差異，其中灰質(zhì)損傷更嚴(yán)重、中間神經(jīng)元的死亡數(shù)目較運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元多，可能是脊髓缺血再灌注損傷致痙攣性癱瘓的病理學(xué)基礎(chǔ)。
　　3.脊髓缺血損傷早期神經(jīng)元興奮性增加、隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)其興奮性逐漸降低，整合功能失調(diào)。中間神經(jīng)元（閏紹細(xì)胞）對(duì)缺血再灌注損傷更為敏感，最終使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元處于“去抑制”狀態(tài)，由此導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元高興奮性反應(yīng)，是造成脊髓缺血再灌注損傷致痙攣性癱瘓的重要電生理學(xué)機(jī)制。
　　4.脊髓缺血再灌注損傷后