氯碘羥喹對(duì)沙土鼠全腦缺血再灌注后鋅離子致神經(jīng)元死亡的保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf

1、金屬鋅是人體內(nèi)含量第二位的過(guò)渡金屬元素，也是正常生長(zhǎng)發(fā)育、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)代謝、免疫功能等過(guò)程中所必需的元素。在嚙齒類動(dòng)物中，短暫的全腦缺血可以使海馬CA1區(qū)的錐體細(xì)胞出現(xiàn)延遲性神經(jīng)元死亡。有證據(jù)顯示大腦局部缺血中風(fēng)的大鼠皮層中出現(xiàn)了鋅離子從突觸前神經(jīng)元“涌入”突觸后神經(jīng)元的現(xiàn)象。在短暫全腦缺血后神經(jīng)元軸突終末釋放的過(guò)量鋅離子可能是導(dǎo)致腦選擇性延遲神經(jīng)元死亡的重要原因之一。許多研究表明在缺血?jiǎng)游锬Ｐ腕w內(nèi)注射鋅離子螯合劑對(duì)缺血所致的神經(jīng)功

2、能障礙有保護(hù)作用。例如，在全腦缺血模型中給予鋅離子螯合劑Ca—EDTA可以顯著的減少神經(jīng)元死亡，在蒙古沙土鼠全腦缺血模型給予Ca—EDTA可以減輕CA1區(qū)神經(jīng)元的損傷。氯碘羥喹(Clioquinol，CQ，5—氯—7—碘—8—羥喹，分子量：305.5)是一種具有膜通透性和疏水性的鋅離子螯合劑，能穿過(guò)血腦屏障。本研究通過(guò)制作沙土鼠全腦缺血模型并給予CQ，探討CQ對(duì)海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)理。 材料與方法: 一、

3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年2月齡蒙古沙土鼠隨機(jī)分為3組：(1)假手術(shù)對(duì)照組；(2)腦缺血溶劑對(duì)照組(1d，3d，7d)；(3)腦缺血CQ治療組(1d，3d，7d)。二甲基亞砜(DMSO)作為CQ的溶劑。 為了驗(yàn)證CQ有螯合鋅離子的作用，正常2月齡沙土鼠隨機(jī)分為兩組：(1)正常組；(2)注射CQ2小時(shí)組。用硒化鋅金屬自顯影(autometallography，AMG)法檢測(cè)CQ對(duì)鋅離子的螯合作用。 二、沙土鼠全腦缺血

4、模型的建立 沙土鼠用4％戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg，ip)，頸部正中切口游離迷走神經(jīng)纖維暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈(假手術(shù)對(duì)照組不夾閉)，造成全腦缺血，夾持10min后松開(kāi)動(dòng)脈夾，見(jiàn)雙側(cè)頸總動(dòng)脈血液充盈，雙側(cè)頸總動(dòng)脈重新恢復(fù)供血。頸部切口用4號(hào)尼龍線縫合，酒精消毒。術(shù)后沙土鼠在加熱燈照射下保溫2h直至復(fù)蘇。腦缺血溶劑對(duì)照組在術(shù)后立即腹腔注射溶劑DMSO(10mg/kg/day)，腦缺血CQ治療組在術(shù)后立即

5、腹腔注射CQ溶液(10mg/kg/day)，按照1d，3d，7d的時(shí)間點(diǎn)取材。 三、檢測(cè)指標(biāo): 應(yīng)用硒化鋅金屬自顯影AMG法和TSQ鋅離子熒光染色檢測(cè)CQ螯合鋅離子的作用。應(yīng)用Nissl染色檢測(cè)腦缺血后溶劑對(duì)照組和CQ治療組之間海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的丟失情況。采用TUNEL染色檢測(cè)腦缺血3d CQ是否有對(duì)腦缺血后CA1區(qū)錐體細(xì)胞的保護(hù)作用。采用原位雜交來(lái)檢測(cè)腦缺血3d各組Caspase—3和Caspase—9的mRNA的

6、表達(dá)變化。采用Western Blot來(lái)檢測(cè)在腦缺血1d、3d和7d各組之間Caspase—3和凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)的蛋白含量的變化的情況。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 一、硒化鋅AMG染色結(jié)果 在注射鋅離子螯合劑CQ的正常沙土鼠標(biāo)本切片中可在整個(gè)海馬區(qū)域見(jiàn)AMG陽(yáng)性反應(yīng)與未注射鋅離子螯合劑的沙土鼠標(biāo)本切片相比染色減弱，在齒狀回和苔蘚纖維處的陽(yáng)性反應(yīng)也與未注射鋅離子螯合劑CQ

7、沙土鼠切片相比較減弱。 二、TSQ鋅離子熒光染色結(jié)果 熒光顯微鏡下觀察，在沙土鼠海馬苔蘚纖維和齒狀回部位腦缺血3d后TSQ熒光染色較假手術(shù)對(duì)照組增強(qiáng)，而注射了鋅離子螯合劑CQ的沙土鼠TSQ熒光染色較假手術(shù)組和溶劑對(duì)照組相比最弱。 三、海馬CA1區(qū)Nissl染色結(jié)果及CA1區(qū)神經(jīng)元計(jì)數(shù) 假手術(shù)對(duì)照組沙土鼠海馬CA1區(qū)未見(jiàn)明顯神經(jīng)元損害性改變。腦缺血1d，3d，7d溶劑對(duì)照組沙土鼠海馬CA1區(qū)可見(jiàn)顯著的錐體細(xì)

8、胞變性、壞死。與溶劑對(duì)照組相比，腦缺血1d，3d，7d CQ治療組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞死亡數(shù)目減少，錐體細(xì)胞較排列，形態(tài)較完整。 四、TUNEL染色結(jié)果 假手術(shù)對(duì)照組沙土鼠在海馬CA1區(qū)僅見(jiàn)少量TUNEL陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞；腦缺血3d CQ治療組沙土鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞內(nèi)呈深棕色的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯較溶劑對(duì)照組減少。腦缺血3d溶劑對(duì)照組海馬CA1區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與CQ治療組之間比較有顯著性差異(P<0.01)。

9、 五、Caspase—3和Caspase—9原位雜交染色結(jié)果 光鏡下見(jiàn)Caspase—3和Caspase—9原位雜交陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物均呈深棕黃色。假手術(shù)對(duì)照組沙土鼠海馬CA1區(qū)僅見(jiàn)少量Caspase—3和Caspase—9原位雜交陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞。腦缺血3d CQ治療組沙土鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞內(nèi)呈深棕黃色的Caspase—3和Caspase—9原位雜交陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。腦缺血3d溶劑對(duì)照組海馬CA1區(qū)Caspase—3和C

10、aspase—9原位雜交陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與CQ治療組之間比較有顯著性差異(P<0.01)。 六、Caspase—3和AIF的Western blot結(jié)果 腦缺血術(shù)后1d，3d，7d的溶劑對(duì)照組Caspase—3和AIF在動(dòng)物海馬的表達(dá)高于CQ治療組動(dòng)物。其中Caspase—3(17KD)溶劑對(duì)照組和CQ治療組相比，在1d、3d、7d時(shí)間點(diǎn)各組(P<0.01)；Procaspase—3(32KD)溶劑對(duì)照組和CQ治療組相比，在1

11、d、7d時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，在3d時(shí)間點(diǎn)(P<0.01)；AIF(67KD)溶劑對(duì)照組和CQ治療組相比，在1d時(shí)間點(diǎn)(P<0.01)，在3d、7d時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)。 結(jié)論: 1、應(yīng)用AMG染色和TSQ熒光技術(shù)證實(shí)CQ對(duì)鋅離子具有螯合作用。 2、腦缺血后1d、3d和7d CQ治療組CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)目較溶劑對(duì)照組增多。TUNEL染色證實(shí)在腦缺血后3d CQ治療組CA1區(qū)錐體細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較溶劑