缺血后處理對兔脊髓缺血-再灌注損傷的保護效應及機制探討研究.pdf

1、目的
　　 脊髓缺血/再灌注損傷分為原發(fā)和繼發(fā)兩種損傷,繼發(fā)損傷以缺血為主,主要原因有脊髓受壓,脊髓主要供血的根動脈阻斷、損傷或灌注壓太低等。臨床主動脈瘤、血管畸形手術以及心臟手術體外循環(huán)期間等,均可引發(fā)脊髓缺血再灌注損傷[1],導致?lián)p傷平面以下感覺和運動缺失,以及膀胱、腸道和性功能等不可逆的生理功能的障礙,給家庭和社會帶來巨大的精神和經(jīng)濟負擔,已成為現(xiàn)代醫(yī)學中急需攻克的難題。
　　 目前國際上有關脊髓抗缺血/再灌注損傷

2、保護的研究主要集中在神經(jīng)保護劑的開發(fā)和應用,包括自由基清除劑、谷氨酸釋放抑制劑及腺苷,麻醉藥物,阿片受體拮抗劑等藥物[2]。缺血/再灌注損傷機制十分復雜,多年來研究者試圖找到有效的藥物或干預措施來減輕缺血/再灌注損傷,雖然發(fā)現(xiàn)有些藥物或處理措施在實驗動物身上有效,但到目前為止能成功應用于臨床的仍然很少。國內(nèi)對脊髓缺血保護的研究不多,結果報道非常有限,因此必須尋找新的途徑來提高脊髓保護的臨床效果。
　　 雖然缺血預處理是近年來發(fā)現(xiàn)

3、的能減輕缺血/再灌注損傷的最有效方法之一,但其臨床應用價值受到很大的限制。臨床上許多疾病存在或伴隨缺血/再灌注損傷,何時發(fā)生缺血以及發(fā)生何種程度的缺血在大多數(shù)疾病中無法預料,這大大限制了缺血預處理在臨床的應用,這也為再灌注初始采用缺血后處理提供了機會,缺血后處理是一種應用于再灌注早期的新的機械性干預措施,具有可預知性和可控制性的特點,而且其在臨床上應用具有操作簡單、方便、可行的特點,易為外科醫(yī)生所接受,具有缺血預處理無法比擬的優(yōu)勢,前景

4、更加廣闊。
　　 經(jīng)典的缺血后處理,即在缺血后給予幾個短暫的灌注再缺血循環(huán)的處理措施,首先在心臟的缺血/再灌注損傷中被證明有保護作用。2003年,利用犬在體心肌缺血/再灌注模型發(fā)現(xiàn),在長時間再灌注開始早期給予3個循環(huán)30秒缺血/30秒再灌注,可以減輕心肌缺血/再灌注損傷,其心肌保護作用的程度與缺血預適應相當[3]。缺血后適應的心肌保護作用已經(jīng)在不同的動物模型中得到廣泛驗證[4],最新的一項臨床研究更進一步證實了缺血后適應是一種能

5、夠為臨床所接受的心肌保護手段[5]。缺血后適應特異性減輕再灌注損傷,其作用機制未完全闡明,現(xiàn)有的研究表明缺血后適應可以減輕再灌注早期的炎癥反應[3],改善氧自由基代謝[3],抑制線粒體通透性轉運通道(mitochondrial permibility transition pore,mFTP)開放功能[4]和激活再灌注損傷清除激酶信號通路(reperfusion injury salvage kinase.RISK)等[6]。雖然經(jīng)過多

6、年的研究,缺血預適應已經(jīng)成為一種公認的抗缺血保護機制,但同缺血預適應不同,缺血后適應作用切入點為再灌注開始,因此具有更好的臨床應用前景。
　　 隨著認識的不斷深入,對缺血后適應的研究已不局限于心肌保護,已有報道經(jīng)典缺血后適應方法的神經(jīng)保護作用,并確定再灌注開始的數(shù)分鐘是保護作用關鍵[7],并發(fā)現(xiàn)缺血后適應可以和缺血預適應產(chǎn)生協(xié)同保護作用。在進一步研究中,將再灌注早期灌注壓控制在較低的水平(45-55mmHg),結果證明這種再灌注

7、方法也可以顯著減輕缺血后脊髓的神經(jīng)功能損害[8]。同經(jīng)典的缺血后適應法比較,這種控制性低灌注壓再灌注方法沒有附加缺血,可能更易于臨床工作接受,可以認為是一種改良的缺血后適應的方法。
　　 目前關于缺血后適應神經(jīng)保護作用的研究甚少,相關分子機制尚不清楚,有待進一步研究。研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinnositol3 kinase-Akt,PI3K-Akt)信號通路在腦缺血后神經(jīng)元存活過程中發(fā)揮重要作用[

8、9],細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular sugnal-related kinases,ERK)信號途徑則介導了促紅細胞生成素等腦缺血的神經(jīng)保護作用[10]。PI3K/Akt和ERK共同組成了RISK通路,RISK通路在脊髓缺血/再灌注損傷神經(jīng)保護作用的研究尚待進一步研究。
　　 另有研究發(fā)現(xiàn)mPTP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷神經(jīng)元死亡的過程中發(fā)揮重要,抑制其開放則有助于減輕神經(jīng)損傷[11]。應激狀態(tài)下mPTP開放可以導致位

9、于膜間隙的一些在細胞凋亡中起關鍵作用的因子釋放,同時導致離子和代謝物失衡,激活磷脂酶,核酶,蛋白水解酶等降解酶。多種因素可以影響mPTP開放的功能,在脊髓缺血/再灌注損傷中RISK通路能否影響mPTP開放的功能,尚有待研究。本課題擬在前期研究的基礎之上,利用相同的脊髓缺血模型,比較兩種缺血后適應方法對于缺血脊髓的神經(jīng)保護作用效果,并深入探討上述兩種缺血后適應方法對于再灌注早期RISK活性,mPTP開放的影響,闡明其神經(jīng)保護機制的相關分子

10、機制,為進一步可能的臨床應用提供理論和實踐依據(jù)。
　　 實驗材料
　　 1、實驗動物
　　 雄性日本大耳白兔(體重在2-2.5kg之間),由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。
　　 2、實驗試劑
　　 PD98059、LY294002(santa,美國);Bcl-2/BaxmRNA引物(大連寶生物公司);Bcl-2/Bax多克隆抗體(即用型)(santa,美國);caspase-3多克隆抗體(Neom

11、arker,美國);p-Akt、p-ERK多克隆抗體(即用型)(大連博士德),Histostain TM Plus Kits S-P9000免疫組化染色試劑盒、ZLI-9108濃縮型DAB試劑盒(北京中杉生物公司);Trizol(Invitrogen,美國);One step RT-PCR試劑盒(大連寶生物公司);聚偏二氟乙烯(PVDF)蛋白印跡膜(Bio-Rad,美國);烏拉坦氨基甲酸乙酯(烏拉坦)(上海化學試劑采購供應站);丙二醛測

12、定試劑盒及超氧化物歧化酶測定試劑盒(南京建成生物工程公司);細胞凋亡原位檢測試劑盒(華美生物工程公司);PBS等其它試劑為國產(chǎn)分析純。
　　 3、主要實驗儀器
　　 (1)振蕩水浴箱(GFL THERMOLAB,美國)
　　 (2)超低溫冰箱(SANYO MDF-U,日本)
　　 (3)旋渦振蕩器(VORTEX-2 GENE,美國)
　　 (4)水平板電泳系統(tǒng)(BIO-RAD Sub-cell G

13、T,美國)
　　 (5)通用電泳儀(BIO-RAD PowerPac200,美國)
　　 (6)臺式低溫高速冷凍離心機(Sigma3K30,美國)
　　 (7)顯微圖像分析系統(tǒng)(Olympus AX70/Coolsnapfx/MetaMorph,日本)
　　 (8)電熱恒溫鼓風干燥箱(余姚TDW,中國)
　　 (9)自動電泳凝膠成像分析儀(Alphainnotech ChemiImager5500

14、,美國)
　　 (10)小型垂直電泳儀(Bio-Rad Mini-ProteinⅢ,美國)
　　 (11)半干轉印儀(Bio-Rad Seimidry transfer system,美國)
　　 (12)自動封膜儀(江蘇儀器設備公司,中國)
　　 (13)722型分光光度計(上海分析儀器廠,中國)
　　 (14)UV-300型紫外分光光度計(Unicam,美國)
　　 (15)HEIDO

15、LPH DIAX900型勻漿機(德國)
　　 (16)PTC-100型PCR擴增儀(美國)
　　 (17)GLS-700D型數(shù)碼凝膠掃描分析系統(tǒng)(上海,中國)
　　 (18)A-200 Ds電子天平(美國)
　　 (19)B-Brown微量泵(德國)
　　 (20)Gem Premier3000型血氣分析儀(IL,美國)
　　 (21)超純水裝置(MILLIPORE MILLI-Q,美國)

16、
　　 (22)實驗室制冰機(ZIGERA2BE-70-35,德國)
　　 (23)小型臺式離心機(SIGMA1-13,美國)
　　 (24)3K15型高速離心機(sigma,德國)
　　 (25)PH計(WTW InoLab,德國)
　　 (26)電動高壓消毒鍋(HIRAYAMA HVE-50,美國)
　　 (27)HSS-1數(shù)字超級恒溫浴槽(成都儀器廠,中國)
　　 (28)A

17、O石蠟切片機,光學顯微鏡(奧林巴斯),EJM1200-EX透射電鏡,數(shù)碼相機(日本SONY公司)。
　　 (29)4F球囊充氣導管(美國)
　　 (30)PE-10(寧波市科技園區(qū)安來軟件科技有限公司)
　　 實驗方法：
　　 1、建立日本大耳白兔脊髓缺血/再灌注模型
　　 1.1動物模型制備:雄性日本大耳白兔耳緣靜脈注射20％烏拉坦(1mg/kg)進行麻醉,連續(xù)監(jiān)測心率,耳緣中動脈置管,測量近端

18、動脈血壓,股動脈置管檢測遠端血壓,直腸內(nèi)置入溫度傳感器,持續(xù)監(jiān)測體溫,應用電熱毯維持核心溫度37±1℃。耳緣靜脈插管,確保輸液通路,術中持續(xù)輸入復方乳酸鈉4 ml·kg-1·h-1。經(jīng)典缺血后處理模型行正中剖腹,游離顯露左腎動脈,動脈下1cm處阻斷腹主動脈25min后開放主動脈,再灌注1min后給予5循環(huán)缺血后適應(阻斷腹主動脈1min/開放1min為一循環(huán));改良缺血后處理模型采用球囊導管腎動脈下水平阻斷兔腹主動脈25min,以遠端動

19、脈壓力低于20mmHg為完全阻斷的標準,再灌注開始的10min球囊部分排空,將腹主動脈遠端血壓控制在45-55mmHg:之后絲線縫合,回籠飼養(yǎng).
　　 1.2鞘內(nèi)置管:將已經(jīng)消毒的PE-10導管從L5-6插入7.0～8.0 cm,至脊髓胸段,回抽有腦脊液后即可用于實驗。
　　 2、實驗分組和取材
　　 實驗共分13組,S組(假手術對照組sham,n=12):打開腹腔暴露腎下腹主動脈,不行阻斷;C組(對照組cont

20、rol,n=12):腎動脈下水平阻斷腹主動脈25min;PA組(經(jīng)典缺血后適應組postcon A,n=12):腎動脈下水平阻斷腹主動脈25min;再灌注1min后給予5循環(huán)缺血后適應(阻斷腹主動脈1min/開放1min為一循環(huán));PB組(改良缺血后適應組postcon B,n=12):腎動脈下水平阻斷腹主動脈25min,再灌注開始的10min球囊部分排空,將腹主動脈遠端血壓控制在45-55mmHg:D組(DMSO組,n=6只),腹主動

21、脈開放前1min鞘內(nèi)注射10％。DMS020ul,之后進行改良缺血后處理;PY5組(5ug組,n=6只),腹主動脈開放前1min鞘內(nèi)注射LY2940025ug(20ul),之后進行改良缺血后處理;PY10組(10ug組,n=6只)腹主動脈開放前1min鞘內(nèi)注射LY29400210ug(20ul),之后進行改良缺血后處理;PY20組(20ug組,n=6只)腹主動脈開放前1min鞘內(nèi)注射LY29400220ug(20ul),之后進行改良缺血

22、后處理;LY組(n=6只)腹主動脈開放前1min鞘內(nèi)注射LY29400210ug(20ul)。PD1組(1ug組,n=6只),腹主動脈開放前1min鞘內(nèi)注射PD980591ug(20ul),之后進行改良缺血后處理;PD3組(3ug組,n=6只)腹主動脈開放前1min鞘內(nèi)注射PD980593ug(20ul),之后進行改良缺血后處理;PD9組(9ug組,n=6只)腹主動脈開放前1min鞘內(nèi)注射PD980599ug(20ul);之后進行改良缺

23、血后處理;PD組(n=6只)腹主動脈開放前1min鞘內(nèi)注射PD980593ug(20ul)。
　　 在各實驗時點嚴格滅RNA酶操作下取各組脊髓組織,一部分放入TRIZOL液中保存;一部分放入液氮保存;一部分于10％福爾馬林溶液中固定,另一部分放入3％戊二醛中固定。
　　 3、檢測指標
　　 (1)生理學指標:分別監(jiān)測缺血前,缺血15min及再灌注10min后的MBP,HR及動脈血氣(PH、PaO2、PaCO2、l

24、ac)值。
　　 (2)神經(jīng)運動功能評分:術后觀察28天,采用Tarlov法分別于術后1,3,7,28天對兔后肢運動功能進行評分;改良的Tarlov分級評分標準:0分,沒有可覺察的下肢活動;1分,有可覺察的關節(jié)自主活動;2分,后肢可自由活動但無法站立;3分,可站立但無法行走;4分,后肢功能完全恢復,能正常行走。
　　 (3)HE染色觀察脊髓神經(jīng)病理學改變:再灌注1天深度麻醉動物后處死,分別取脊髓缺血節(jié)段L4制成石蠟包埋組

25、織切片。常規(guī)HE染色,光鏡下盲法計數(shù)脊髓灰質(zhì)前角內(nèi)健存運動神經(jīng)元(胞漿中可見Niss1體),取平均值。
　　 (4)TUNEL法神經(jīng)元凋亡的檢測:再灌注1天后取L4段脊髓,采用原位雜交(TUNEL染色)。
　　 10％福爾馬林溶液中固定脊髓組織經(jīng)脫水、切片后,SP法進行免疫細胞化學染色,染色步驟按試劑盒說明書進行操作。DAB顯色,蘇木素輕度復染,脫水,透明,封片。采用顯微圖像分析系統(tǒng)(Olympus AX70/Cools

26、napfx/MetaMorph)圖像處理分析儀檢測,每組在高倍鏡下(×400)隨機選擇6個視野,檢測兔脊髓神經(jīng)元細胞凋亡程度。
　　 (5)電鏡觀察
　　 取脊髓組織約1mm3,經(jīng)充分洗滌后,用1％餓酸固定,梯度酒精脫水,包埋劑包埋后,半薄切片,顯微鏡下定位,然后做成超薄切片,硝酸鈾及檸檬酸鉛雙重染色,透射電鏡下觀察超微結構并攝像。
　　 (6)羥胺法測定脊髓組織SOD含量,硫代巴比妥酸法測定MDA含量。

27、　　 (7)RT-PCR方法檢測各組細胞Bcl-2mRNA,BaxmRNA表達。
　　 TRIZOL裂解各組細胞后進行總RNA的提取,測定樣品OD260/280確定RNA質(zhì)量。一步法RT-PCR,按寶生物公司逆轉錄反應試劑盒使用說明操作。按試劑盒說明加入反應體系。逆轉錄合成第一鏈cDNA,反應條件為42℃30min,95℃5min。直接進入第二鏈cDNA合成及PCR擴增,反應條件為94℃變性40s,54℃退火40s,72℃延伸

28、60s,38個循環(huán),最后72℃5min結束,4℃保存。取8ulPCR產(chǎn)物于2％的瓊脂糖凝膠電泳,在溴酚藍指示劑到達凝膠底部邊緣時停止電泳。以溴化乙啶液(1ug/ul)覆蓋凝膠,染色5min自動電泳凝膠成像分析儀下觀察拍照。測定電泳條帶密度值。
　　 (8)免疫組織化學染色測定Phospho-Akt,Phospho-ERK蛋白表達。
　　 10％福爾馬林溶液中固定脊萌組織經(jīng)脫水、切片后,SP法進行免疫細胞化學染色,染色步驟

29、按試劑盒說明書進行操作。DAB顯色,蘇木素輕度復染,脫水,透明,封片。采用顯微圖像分析系統(tǒng)(Olympus AX70/Coolsnapfx/MetaMorph)圖像處理分析儀檢測,每組在高倍鏡下(×400)隨機選擇6個視野,測出Phospho-Akt,Phospho-ERK蛋白表達的平均光密度。
　　 (9)免疫蛋白印跡雜交(Western blot)測定Bcl-2、Bax、Caspase-3、Phospho-Akt、Phosp

30、ho-ERK蛋白表達。
　　 分別裂解各組細胞,收集上清,測定蛋白質(zhì)濃度,然后按每個電泳孔道加入50μg蛋白混合樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉膜。先后加入一抗(Bcl-2,Bax,Caspase-3,Phospho-Akt,Phospho-ERK多克隆抗體,稀釋度為1:500)和二抗(羊抗兔單克隆抗體,稀釋度為1:5000)進行雜交。然后進行酶標染色顯色,應用圖像分析軟件分析各電泳條帶的蛋白含量。
　　 4、統(tǒng)計學處理<

31、br>　　 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。數(shù)據(jù)處理采用SPSS12.0統(tǒng)計學軟件。組間比較采用單因素方差分析,均數(shù)間兩兩比較用SNK檢驗。后肢運動功能評分采用非參數(shù)秩和Kruskal-Wallis方法檢驗,P＜0.05認為差異有顯著性。
　　 結果：
　　 1.缺血后處理對兔脊髓缺血/再灌注損傷的保護
　　 S組、C組、PA組、PB組四組在缺血前,缺血15min,缺血后10min時MBP,HR及動脈血氣(PH、PaO

32、2、PaCO2、lac)值無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。C組1、3、7、28天tarlov評分明顯低于缺血后處理組,(P＜0.05)。S組:神經(jīng)細胞輪廓清晰,極性存在,核圓,核仁清楚。尼氏體呈網(wǎng)狀均勻排列于核周,胞漿均勻深染,整個組織結構完整、清楚,無中性粒細胞浸潤,無出血、水腫等異?，F(xiàn)象。C組:神經(jīng)細胞腫脹,極性變鈍,核仁輕度萎縮,尼氏體呈顆粒狀,淡染,組織中有中性粒細胞浸潤;PA、PB組,部分神經(jīng)細胞輕度腫脹,極性稍變鈍,核仁尚清,

33、組織中未見中性粒細胞浸潤。C組細胞凋亡顯著增加,與S組比較差異顯著(P＜0.05);PA組、PB組、較C組細胞凋亡明顯減少(P＜0.05)。PA組、PB組與C組相比p-ERK、p-Akt蛋白表達明顯上調(diào),(P＜0.05)。C組脊髓MDA含量顯著增加,SOD含量顯著降低,與S組比較差異顯著(P＜0.05);PA組、PB組較C組MDA含量顯著減少,SOD含量顯著增加(P＜0.05)。
　　 2.PI3K/Akt及ERK傳導通路抑制劑

34、LY294002和PD98059對缺血后處理兔脊髓缺血/再灌注損傷的作用研究
　　 鞘內(nèi)注射5ugPI3K傳導通路抑制劑LY294002能阻斷缺血后處理的保護作用。5ug、10ug、20ug組Bcl-2mRNA表達明顯降低,BaxmRNA表達明顯增高,p-Akt蛋白表達明顯降低,與PB組相比有顯著差異(P＜0.05);鞘內(nèi)注射1ugERK傳導通路抑制劑PD98059能阻斷缺血后處理的保護作用。1ug、3ug、9ug組Bcl-2m

35、RNA表達明顯降低,BaxmRNA表達明顯增高,p-ERK蛋白表達明顯降低與PB組相比有顯著差異(P＜0.05)。
　　 3.缺血后處理對兔缺血/再灌注損傷脊髓保護的線粒體機制
　　 C組、LY294002、PD98059組與PB組相比胞漿內(nèi)細胞色素C及Caspase-3蛋白表達增高(P＜0.05);線粒體內(nèi)鈣含量明顯增加(P＜0.05).
　　 討論
　　 動物實驗和臨床觀察發(fā)現(xiàn)缺血脊髓血液恢復后,部分

36、動物或患者細胞代謝障礙、結構破壞,神經(jīng)系統(tǒng)癥狀反而加重,因而將這種脊髓血流再灌后產(chǎn)生的脊髓缺血性損傷進一步加重的現(xiàn)象稱為脊髓缺血/再灌注損傷(SCIRI)[12]。研究表明,血液循環(huán)恢復后,雖然脊髓的缺血缺氧有所改善,但血液中的活性氧(ROS)可以引起缺血脊髓再灌注損傷,提示這種損傷不是發(fā)生在缺血期間,而主要發(fā)生在血運恢復、氧分子重新進入脊髓組織后[13]。自Mccord[14]1985年提出缺血/再灌注損傷的概念后,許多學者陸續(xù)證實在

37、多種組織、器官存在缺血/再灌注損傷。近來研究證實自由基損傷及其引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應是導致神經(jīng)系統(tǒng)缺血/再灌注損傷的重要機制。脊髓組織膜結構含有豐富的脂質(zhì),缺血使神經(jīng)細胞線粒體氧化還原酶系脫耦聯(lián),產(chǎn)生大量氧自由基,后者易攻擊脂質(zhì)引發(fā)過氧化反應,從而破壞膜結構的完整性,導致脊髓神經(jīng)元的繼發(fā)性損害。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,測定MDA可直接反映自由基水平,其含量高低是組織細胞損傷的重要標志,而SOD活性則可反映氧自由基清除能力的高低[42

38、]。缺血后處理可通過減少再灌注后氧自由基的過度生成并加速其清除,減輕氧自由基對生物膜結構和功能的破壞,從而發(fā)揮其保護作用。從本實驗可以看出SOD參與了脊髓缺血/再灌注損傷的病理過程。我們將再灌注早期灌注壓力控制在較低水平(45-55mmHg),結果證明這種再灌注方法也可以顯著減輕缺血后脊髓的神經(jīng)功能損害。同經(jīng)典的后適應方法相比較,這種控制性低灌注壓再灌注方法沒有附加缺血,可能更易于為臨床工作所接受,可以認為是一種改良的缺血后適應方法。<

39、br>　　 MAPK家族成員是哺乳動物細胞內(nèi)一組進化保守的細胞信號轉導酶類,作為重要的信號傳遞途徑之一,其連接細胞膜表面受體與決定性基因的表達,被認為是任何胞外刺激由胞外向胞內(nèi)轉導的跨膜信號通路的交匯點。ERK是MAPK家族的一員,研究表明ERK途徑在多種疾病包括缺血/再灌注損傷過程中發(fā)揮著重要作用。細胞外調(diào)控激酶ERK1/2信號傳導通路也很可能參與了缺血后處理過程[16]。迄今為止,在重要臟器的缺血/再灌注損傷研究中,均發(fā)現(xiàn)在損傷早

40、期伴有ERK蛋白激酶的激活。但其在脊髓缺血中的表達及作用研究結果不一。Pd98059是作用于ERK通路中ERK上游的蛋白激酶MEK(MAPK/ERK激酶)的特異性抑制劑,其特異性地抑制ERK的磷酸化而阻斷此通路的細胞信號轉導。Hu等[17]用Western blotting和激光共聚焦顯微鏡在大鼠腦缺血模型上觀察15min腦缺血后MAPK的活性變化,發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注后30min和4h在耐受缺血的CA3/DG區(qū)細胞核有p-ERK表達。另外

41、,有研究表明,ERK激活后,可降低腦缺血/再灌注損傷NMDA受體活性,抑制Ca2+內(nèi)流,具有神經(jīng)元保護作用[18-19];ERK激活后通過信號傳導,活化細胞核內(nèi)不同的轉錄調(diào)節(jié)因子,進而使細胞出現(xiàn)增殖、分化或凋亡。Darling等[20]在兔離體心臟缺血后處理模型持續(xù)再灌注前25min給予ERK1/2抑制劑PD298059后,缺血后處理誘導的心肌梗死面積減少的作用被抑制。
　　 近年來在脊髓缺血/再灌注過程中抗凋亡(促增殖)途徑,

42、如PI3K/Akt途徑,在缺血性損傷保護中的作用受到越來越多的重視。PI3K活化而產(chǎn)生的類脂產(chǎn)物3,4-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)和3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)作為第二信使可激活細胞內(nèi)多種靶蛋白,最終調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、存活等過程[21]。Akt,即絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(PKB),是PI3K直接的下游作用靶點。Akt通過磷酸化一系列凋亡調(diào)控蛋白,如BAD、caspase-9、NF-κB等,進一步調(diào)節(jié)抗凋亡基因的轉錄,

43、促進細胞存活[22]。對PI3K/Akt途徑的調(diào)控可以降低缺血/再灌注引起的腦損傷[6],通過增加Bcl-2的表達、降低Bax的表達和細胞色素c的釋放,發(fā)揮其保護作用[24]。Tsang[6]通過Western blot分析發(fā)現(xiàn)后處理誘導了Akt磷酸化的增強,在使用PI3K抑制劑LY294002后,后處理介導的磷酸化被終止,保護作用同時被取消。Feng等[25]在給予LY294002后取消了心肌保護作用,盡管目前缺血后處理的機制還不很清

44、楚,但大量的研究提示后處理很可能是通過PI3K/Akt途徑以及它的下游靶物發(fā)揮作用的。
　　 有的學者認為PI3 K/Akt和ERK1/2都參與了后處理的保護作用,并且它們的保護作用是通過抑制mPTP的開放而產(chǎn)生的[26]。它能調(diào)節(jié)MPTP的開放以及釋放ROS、凋亡因子加重心肌的缺血性損傷[20]。MPTP的開放導致線粒體內(nèi)膜電位喪失及呼吸鏈解偶聯(lián),細胞色素C及其它促凋亡因子釋放至細胞漿,最終導致細胞發(fā)生凋亡。
　　 本

45、實驗觀察到,缺血組脊髓缺血25分鐘后,再灌注24小時出現(xiàn)神經(jīng)細胞凋亡,神經(jīng)功能障礙,脊髓病理改變。兩種缺血后處理組再灌注24小時后能明顯減少神經(jīng)細胞凋亡的數(shù)量,顯著改善神經(jīng)功能和脊髓病理改變。說明缺血后處理對缺血脊髓的保護作用部分是通過抑制神經(jīng)細胞凋亡來實現(xiàn)的。另外可通過減少再灌注后氧自由基的過度生成并加速其清除,減輕氧自由基對生物膜結構和功能的破壞,從而發(fā)揮其保護作用,SOD參與了脊髓缺血/再灌注損傷的病理過程。通過本實驗研究我們認為

46、ERK通路是神經(jīng)元的存活通路,特異性抑制劑使得ERK通路發(fā)生變化,從另一方面說明ERK參與了缺血后神經(jīng)元的保護。另外,我們通過考察缺血/再灌注早期的神經(jīng)保護作用,發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注早期,髓腔內(nèi)注射PI3K的抑制劑LY294002取消了神經(jīng)保護作用。提示我們?nèi)毖?再灌注后ERK及PI3K/Akt途徑參與了促進細胞存活的保護性機制,且與mPTP相關,可能機制尚有待研究。本實驗為臨床治療缺血性脊髓損傷提供了一定的理論依據(jù)。
　　 結論:

47、
　　 在脊髓缺血/再灌注過程中應用缺血后處理可在一定程度上緩解缺血/再灌注對脊髓組織的損傷,減少細胞凋亡,并通過線粒體途徑對脊髓組織具有一定程度的抗缺血性保護作用。PI3K/Akt及ERK傳導通路抑制劑LY294002和PD98059明顯阻斷缺血后處理兔脊髓缺血/再灌注損傷的保護作用:脊髓細胞凋亡增加,Bcl-2蛋白表達顯著降低、Bax蛋白表達顯著增強,表明抑制劑組p-Akt及p-ERK正常表達受到破壞,造成一系列分子生物學改