NDRG2在腦缺血再灌注損傷中的作用及其機制研究.pdf

1、人NDRG2是我校于1999年首次克隆得到的，屬于NDRG（N-myc downstream regulated gene 2）家族，NDRG家族包括四個成員：NDRG1，NDRG2，NDRG3和NDRG4。大多文獻(xiàn)報道，該家族成員可能為抑癌基因，并可能與細(xì)胞增值與分化有關(guān)，但具體功能還有待進(jìn)一步研究。在正常成年人大腦中NDRG2含量較高，且在灰質(zhì)的表達(dá)要高于白質(zhì)。正常成年小鼠大腦各個區(qū)域均有不同程度的表達(dá)。另外在阿爾茲海默病人的大腦中

2、NDRG2的表達(dá)升高。因此NDRG2與中樞神經(jīng)系統(tǒng)及疾病關(guān)系較為密切。腦中風(fēng)被認(rèn)為是世界上世界上致死致殘的主要原因之一，這個難題的攻克一直是各國醫(yī)學(xué)工作者致力研究的課題。腦缺血及后續(xù)的再灌注損傷引發(fā)的一系列病理生理變化，如興奮性中毒、酸中毒、離子失衡、梗死周圍去極化、氧化應(yīng)激、炎癥和凋亡等，對人體造成不同程度的損害。但目前并沒有治療腦中風(fēng)切實有效的方法。局灶性腦缺血可導(dǎo)致一個損傷較重的缺血核心區(qū)的形成及其周圍損傷較輕的缺血半暗帶的形成。

3、這個缺血半暗帶的存在理論上證明治療性的補救方法是可能的。近年來，缺血半暗帶更是被定義為一個多分子的半暗帶，為缺血腦損傷的治療提供了一個新穎的研究前景。研究發(fā)現(xiàn)腦缺血過程中的血流減少和低氧可以激活一些潛在的損傷性分子和保護性分子的表達(dá)。因此在研究這些分子的過程中，將逐步尋找治療腦中風(fēng)的靶點。本實驗室研究人員已經(jīng)證明，在低氧的條件下NDRG2表達(dá)顯著上調(diào)，且與低氧誘導(dǎo)的凋亡密切相關(guān)。因此我們假設(shè)，在局灶性腦缺血后，在大腦低氧狀態(tài)下，NDRG

4、2的表達(dá)是不是也會升高，且其升高也涉及凋亡相關(guān)分子，參與了凋亡相關(guān)作用。先前我們實驗室證明了NDRG2表達(dá)在大腦不同的區(qū)域，如大腦皮質(zhì)、臭球、中腦、海馬和丘腦，其中在中腦和丘腦的水平較高。文獻(xiàn)也證明NDRG2定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞而非神經(jīng)元細(xì)胞。在目前我們的研究中，分別探討了NDRG2大鼠腦缺血再灌注損傷后的作用及離體培養(yǎng)的C6細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪（Oxygen and glucose deprivation，OGD）處理后的表達(dá)及凋亡相關(guān)機制研

5、究。具體實驗計劃及結(jié)果如下：
　　第一部分:NDRG2在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后的表達(dá)及其功能
　　目的：研究大鼠局灶性腦缺血后NDRG2的表達(dá)及其功能
　　方法：雄性SD大鼠，采用大腦中動脈閉塞術(shù)構(gòu)建大鼠局灶性腦缺血模型，按隨機數(shù)字法分組。給與120min缺血，并于再灌注4h、12h、24h和72h后處死。此外，設(shè)立假手術(shù)Sham組，除不插入栓線外，其余處理都同MCAO組相同。動物處死后，做TTC染色確定缺血半暗

6、區(qū)，用免疫組化法定性檢測NDRG2蛋白的分布，Western-blot定量測NDRG2蛋白表達(dá)，RT-PCR半定量測NDRG2mRNA表達(dá)，NDRG2和GFAP免疫熒光雙標(biāo)法測NDRG2的細(xì)胞定位。細(xì)胞凋亡用TUNEL法檢測。
　　結(jié)果：缺血再灌24小時后，NDRG2主要表達(dá)于缺血半影區(qū)的類星形膠質(zhì)細(xì)胞中，且NDRG2蛋白表達(dá)在再灌4小時開始增加，再灌24小時達(dá)到高峰，再灌72小時與假手術(shù)相比無統(tǒng)計學(xué)意義。NDRG2mRNA的表達(dá)

7、和蛋白表達(dá)趨勢一致。免疫熒光雙標(biāo)顯示，NDRG2定位于GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞，在假手術(shù)組主要定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿，而缺血再灌24小時候則主要定位于DAPI標(biāo)記的胞核。TUNEL染色結(jié)果顯示，缺血再灌后凋亡細(xì)胞增加，且通過TUNEL和NDRG2雙標(biāo)檢測顯示：NDRG2信號與TUNEL陽性細(xì)胞存在共定位。
　　結(jié)論：本實驗室首次證明局灶性腦缺血后缺血半暗區(qū)NDRG2的表達(dá)上調(diào)。NDRG2在缺血再灌后定位于半暗區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中

8、。局灶性腦缺血后NDRG2的表達(dá)從星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿轉(zhuǎn)移到胞核。NDRG2可能涉及中風(fēng)后的細(xì)胞凋亡。
　　第二部分:NDRG2在C6細(xì)胞OGD后的表達(dá)及其在細(xì)胞凋亡中的作用
　　實驗一：IL-6誘導(dǎo)C6細(xì)胞分化
　　目的：將C6細(xì)胞由IL-6誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞
　　方法：常規(guī)培養(yǎng)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，參考成熟的文獻(xiàn)，將C6細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞生長密度達(dá)1×106個/孔后，給予IL-6誘導(dǎo)分化24小時，倒置顯微鏡

9、觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，提取細(xì)胞蛋白，Western-blot測誘導(dǎo)前后GFAP蛋白的表達(dá)，定量的檢測分化狀態(tài)。
　　結(jié)果：IL-6誘導(dǎo)分化24小時后，顯微鏡下顯示C6細(xì)胞由正常的扁平多極樣的形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)分化后的具有兩極突起的紡錘體形態(tài)，細(xì)胞出現(xiàn)更多更長的細(xì)絲狀類軸突狀突起，分化為類星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。Western-blot結(jié)果顯示與正常C6細(xì)胞相比，IL-6誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞中GFAP的表達(dá)明顯升高。
　　結(jié)論：我們通過IL-

10、6誘導(dǎo)C6細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，從而模擬大體的星形膠質(zhì)細(xì)胞，有助于進(jìn)一步的研究。
　　實驗二：NDRG2在C6細(xì)胞OGD后的表達(dá)
　　目的:研究NDRG2在C6細(xì)胞OGD后的表達(dá)變化及細(xì)胞定位
　　方法：誘導(dǎo)分化后的C6細(xì)胞，構(gòu)建OGD模型來模擬中風(fēng)。細(xì)胞在OGD4h并再氧合2h、12h和24h后終止培養(yǎng)。并設(shè)立正常對照組，除不施行OGD，余同。Western-blot檢測各組細(xì)胞NDRG2蛋白表達(dá)。RT-PCR法測

11、各組細(xì)胞NDRG2的mRNA表達(dá)。GFAP和NDRG2免疫熒光雙標(biāo)法檢測各組細(xì)胞的定位情況。將細(xì)胞胞漿和胞核分別提取蛋白后，Western-blot分別測各組NDRG2的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：Western-blot結(jié)果顯示，與正常未受處理的C6細(xì)胞相比，OGD與再氧合后2小時后，NDRG2的蛋白水平開始增加，到再氧合后24小時，達(dá)到高峰。與Western-blot結(jié)果一致的是，RT-PCR結(jié)果也顯示OGD與再氧合后2小時后，ND

12、RG2的mRNA水平開始增加，到再氧合后24小時，達(dá)到高峰。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫細(xì)胞化學(xué)揭示，在正常IL-6誘導(dǎo)的C6細(xì)胞中，NDRG2與GFAP存在共定位，揭示其主要表達(dá)在胞質(zhì)，而與DAPI的核染未發(fā)生共定位。而在OGD和再氧合后的細(xì)胞中，NDRG2不僅與GFAP共定位，更與DAPI的核染具有強烈的共定位。為了進(jìn)一步證實，分離提取胞質(zhì)和胞核后的Western-blot結(jié)果也與此結(jié)果一致，證明NDRG2在OGD后的C6細(xì)胞中發(fā)生了核

13、轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)論：我們首次證實OGD后，C6細(xì)胞中NDRG2的表達(dá)顯著上調(diào)，并隨再氧合時間增加而增加。OGD后NDRG2由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到核內(nèi)發(fā)揮作用，提示NDRG2可能參與細(xì)胞核內(nèi)某些功能。
　　實驗三：NDRG2在OGD后C6細(xì)胞凋亡中的作用和機制
　　目的：研究NDRG2與OGD后C6細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)系及相關(guān)機制
　　方法：首先構(gòu)建大鼠NDRG2過表達(dá)pEGFP-C1載體以及NDRG2siRNA載體。接著用脂質(zhì)

14、體Lipofectamine 2000分別將NDRG2過表達(dá)pEGFP-C1載體和空載體Vector、NDRG2siRNA載體和陰性對照Control轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時后，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，Western-blot測NDRG2表達(dá)來鑒定轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染結(jié)束后用MTT法測細(xì)胞活力。TUNEL法測C6細(xì)胞OGD后的凋亡情況。接著在轉(zhuǎn)染24小時后給予各組細(xì)胞OGD4h及再氧合24h，Western-blot測凋亡相關(guān)分子BAX

15、、BCL-2的表達(dá)。
　　結(jié)果：通過測序及Western-blot鑒定，構(gòu)建載體成功。且在成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染NDRG2siRNA載體，可促進(jìn)細(xì)胞生長，而轉(zhuǎn)染NDRG2過表達(dá)pEGFP-C1載體后，對細(xì)胞生長存在抑制作用。TUNEL結(jié)果顯示，OGD后C6細(xì)胞發(fā)生了明顯的凋亡。Western-blot測BAX和Bcl-2結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NDRG2siRNA載體后，BAX的表達(dá)降低，而轉(zhuǎn)染NDRG2過表達(dá)pEGFP-C1載

16、體后，BAX的表達(dá)升高，二者Bcl-2的蛋白表達(dá)均未發(fā)生變化。
　　結(jié)論：NDRG2過表達(dá)可抑制細(xì)胞生長，而干涉NDRG2表達(dá)后，可促進(jìn)細(xì)胞生長；NDRG2過表達(dá)后，抗凋亡因子BAX水平上調(diào)，促凋亡因子Bcl-2水平未發(fā)生變化，BAX/Bcl-2比值上調(diào)；而NDRG2被干涉后，抗凋亡因子BAX水平下調(diào)，促凋亡因子Bcl-2水平也未發(fā)生變化，BAX/Bcl-2比值下調(diào)，揭示NDRG2可能參與了促凋亡作用。
　　總之，本實驗首次

17、證明NDRG2在大鼠腦缺血再灌注損傷后發(fā)生顯著上調(diào)，且主要定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞。我們也首次證明NDRG2在再灌注損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了核轉(zhuǎn)位。且在再灌注損傷后的凋亡陽性細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了NDRG2的表達(dá)，揭示了NDRG2可能參與了再灌注損傷后的凋亡過程。接著我們進(jìn)一步通過離體試驗，首次證明NDRG2在C6細(xì)胞OGD后顯著上調(diào)，也發(fā)生了明顯的核轉(zhuǎn)位。將NDRG2過表達(dá)或干涉后，進(jìn)一步證明NDRG2通過上調(diào)凋亡相關(guān)因子BAX/Bcl-2，參與