固有免疫分子NLRP3在腦缺血再灌注損傷中的作用及機制.pdf

1、近些年來，腦血管疾病在世界范圍內已經成為最主要的死亡原因之一，這其中，腦缺血性疾病所占比例超過80％。早期恢復腦血流再灌注是救治腦缺血患者最有效的手段。但是再灌注治療有其兩面性:一方面血管再通，可使缺血腦組織功能得以恢復，病情得到控制，但另一方面部分患者腦功能不僅沒能恢復，反而出現病情進一步加重，此即缺血再灌注損傷。實驗證明，多種病理過程都可引起缺血再灌注損傷發(fā)生。研究再灌注損傷的機制，為治療腦缺血疾病治療及再灌注損傷的預防提供了重要理

2、論基礎。
　　固有免疫系統(tǒng)被視為機體的第一道防線。入侵機體的病原體表面含有病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，它們可以被含有模式識別受體(pattern recognition receptors，PRR)的固有免疫細胞識別，進而啟動免疫應答。NLRP3是胞漿內模式識別受體NOD樣受體家族一員，當細胞受到感染等刺激時，被激活NLRP3能夠通過結合蛋白ASC(a

3、poptosis-associated speck-like protein containing)招募pro-caspase-1，并形成NLRP3炎性體。在炎性體的作用下，pro-caspase-1被激活成為caspase-1，而后者進一步將IL-18和IL-1β的前體裂解成為有重要生物活性的炎癥因子，可以參與多種炎癥反應過程。近年來的研究表明，阿爾茨海默病、2型糖尿病、動脈粥樣硬化、炎性腸病等的發(fā)病與進展都與NLRP3有密切關聯，但

4、是NLRP3在腦血管疾病中的作用尚不明確。本實驗擬通過構建腦中動脈栓塞模型和細胞的OGD模型從體內和體外兩方面來研究NLRP3在缺血再灌注損傷中的作用及可能的機制。
　　目的:
　　1、研究小鼠缺血再灌注損傷后NLRP3及其下游分子在腦內的表達及其作用;
　　2、研究小膠質細胞和血管內皮細胞在NLRP3介導下加重缺血再灌注損傷的機制;
　　3、研究缺血再灌注損傷中NADPH氧化酶對NLRP3通路的調控作用。

5、>　　方法:
　　第一部分:小鼠缺血再灌注損傷后NLRP3及其下游分子在腦內的表達及作用
　　1、野生型小鼠缺血再灌注模型建立及模型評價。
　　1.1、實驗小鼠隨機分組，建立腦中動脈栓塞模型。
　　1.2、通過神經學評分、TTC染色評價模型是否建立成功。
　　2、腦缺血再灌注損傷后NLRP3在小鼠腦中表達的變化及分布通過實時定量PCR、Western Blot、組織免疫熒光染色檢測NLRP3在損傷后的表達變

6、化及腦內分布。
　　3、通過RT-PCR來檢測腦內四種主要細胞NLRP3mRNA的表達情況。
　　4、NLRP3基因敲除鼠經缺血再灌注處理后腦損傷改變及機制。
　　4.1、NLRP3基因敲除鼠基因型鑒定、分組及模型制備。
　　4.2、通過小鼠腦MRI平掃反映小鼠腦損傷整體程度;通過HE染色、Nissl染色、TUNEL染色分析組織損傷和神經元凋亡程度。
　　4.3、血管神經單元形態(tài)和功能檢查。
　　4.

7、4、WesternBlot和ELISA分別檢測各組腦組織中Caspase-1和細胞因子的表達變化。
　　4.5、WesternBlot和明膠酶譜法分別檢測各組腦組織中MMP9的蛋白含量和活性。
　　第二部分:小膠質細胞在NLRP3介導下加重缺血再灌注損傷的機制
　　1、糖氧剝奪(Oxygenand Glucose Deprivation，OGD)模型建立
　　本實驗選用小鼠來源的小膠質細胞株BV2細胞作為研究對象

8、。將細胞隨機分組。Western Blot檢測OGD處理后BV2細胞中NLRP3、Caspase-1、NOX2表達以及NADPH氧化酶活性變化。
　　2、對分別轉染shRNA-NLRP3和shRNA-NOX2的BV2細胞進行OGD處理，隨后檢測NLRP3下游分子的變化。
　　2.1、BV2細胞轉染。
　　2.2、對轉染shRNA-NLRP3的BV2細胞進行OGD處理，隨后檢測細胞NLRP3下游分子的變化。
　　2

9、.3、對轉染shRNA-NOX2的BV2細胞進行OGD處理，隨后檢測細胞NLRP3的蛋白變化。
　　2.4、BV2細胞被分別轉染shRNA-NLRP3和shRNA-NOX2并接受OGD處理，隨后通過ELISA檢測其細胞因子的變化。
　　3、神經元與BV2細胞共培養(yǎng)實驗。
　　BV2細胞在共培養(yǎng)上層皿孵育過夜。對分別轉染空質粒和shRNA-NLRP3的BV2細胞進行OGD處理。然后使之與下層皿中的神經元共同培養(yǎng)。通過TU

10、NEL染色計數神經元細胞凋亡率。
　　第三部分:內皮細胞在NLRP3介導下加重缺血再灌注損傷的機制
　　1、內皮細胞OGD模型建立
　　本實驗選用小鼠來源的腦微血管內皮細胞株bEND.3細胞作為研究對象。將細胞隨機分組。WesternBlot檢測OGD處理后bEND.3細胞中NLRP3、Caspase-1、MMP2/9、ZO-1、TJP-2表達及Caspase-1活性變化。
　　2、對轉染shRNA-NLRP3的

11、bEND.3細胞進行OGD處理，隨后檢測相關分子的變化
　　2.1、脂質體介導的bEND.3細胞轉染。
　　2.2、bEND.3細胞轉染shRNA-NLRP3并接受OGD處理后，通過WesternBlot檢測其MMP2/9、ZO-1、TJP-2的蛋白表達變化。
　　2.3、ELISA檢測OGD處理后上述各組細胞培養(yǎng)基中細胞因子的表達變化。
　　3、體外內皮細胞通透性實驗
　　內皮細胞接種到膠原包被的小室內，

12、孵育細胞48小時直至形成單層細胞。OGD處理后，通過測量穿過膠原層的dextran含量來反映腦內皮細胞通透能力。
　　4、IL-1β對內皮細胞通透性的影響
　　為驗證IL-1β對內皮細胞通透性的影響，我們使用含有不同濃度IL-1β的培養(yǎng)基培養(yǎng)內皮細胞，并檢測內皮細胞通透性改變及相關分子表達。
　　第四部分:缺血再灌注損傷中NADPH氧化酶對NLRP3通路的調控作用
　　1、野生型小鼠腦缺血再灌注后NOX2表達及活

13、性變化
　　2、腦缺血再灌注后野生型及NOX2-/-小鼠腦損傷形態(tài)學比較
　　通過小鼠腦MRI平掃反映小鼠腦損傷整體程度。水腫面積分析及神經學評分進一步證實。
　　3、Western Blot檢測NOX2-/-小鼠損傷后NLRP3表達變化
　　4、數據處理
　　結果:
　　第一部分:小鼠缺血再灌注損傷后NLRP3及其下游分子在腦內的表達及作用
　　1、野生型小鼠缺血再灌注模型建立及模型評價

14、>　　每組平均有15％小鼠因為死亡或是神經學評分小于3分而被剔除。
　　2、腦缺血再灌注損傷后NLRP3在小鼠腦中表達的變化及分布
　　通過實時定量PCR和WesternBlot分析，我們發(fā)現NLRP3在損傷后表達有顯著的升高，并且在24小時達到高峰。通過免疫熒光染色得出，NLRP3主要表達于小膠質細胞和血管內皮細胞。另外損傷后Caspase-1和細胞因子IL-1β、IL-18表達也呈升高趨勢。
　　3、通過RT-PC

15、R來檢測腦內四種主要細胞NLRP3mRNA的表達情況
　　通過RT-PCR分析，NLRP3的mRNA主要表達于小膠質細胞和血管內皮細胞
　　4、NLRP3基因敲除鼠經缺血再灌注處理后腦損傷改變及機制
　　通過MRI平掃我們發(fā)現NLRP3缺失后，再灌注腦損傷的面積明顯縮小，同時腦水腫程度也有所減輕。HE染色，Nissl染色和TUNEL染色從組織學和神經元凋亡方面證明在敲除NLRP3后腦損傷減輕。我們采用依文思藍外滲試驗和

16、電鏡成像分別檢測再灌注損傷后血管神經單元功能和形態(tài)的變化，并且我們發(fā)現盡管缺血再灌注后血管神經單元的功能和形態(tài)都出現明顯損傷，但是NLRP3敲除鼠血腦屏障損傷較野生鼠輕，表現為依文思藍外滲量降低，內皮細胞形態(tài)良好，緊密連接較完整，血管周圍水腫不明顯。
　　通過進一步分子水平檢測，我們發(fā)現腦損傷后Caspase-1、MMP9、細胞因子的高表達都可以因為NLRP3的敲除有明顯降低。
　　第二部分:小膠質細胞在NLRP3介導下加重

17、缺血再灌注損傷的機制
　　1、糖氧剝奪(Oxygenand Glucose Deprivation，OGD)模型建立
　　建立OGD模型，通過WesternBlot分析，我們檢測到BV2細胞中NLRP3、Caspase-1、NOX2表達在OGD后有顯著升高，Caspase-1、NOX2的活性也有升高趨勢。
　　2、對分別轉染shRNA-NLRP3和shRNA-NOX2的BV2細胞進行OGD處理，隨后檢測NLRP3下游分

18、子的變化
　　2.1、Western Blot顯示，與對照組BV2細胞相比，轉入shRNA-NLRP3或shRNA-NOX2的BV2細胞NLRP3或NOX2表達明顯降低，有顯著性差異。
　　2.2、ShRNA-NLRP3的轉染所引起的NLRP3表達下降可以削弱OGD所引起的Caspase-1表達及活性升高程度。
　　2.3、ShRNA-NOX2的轉染所引起的NOX2表達下降可以減弱OGD所引起的NLRP3表達升高程度。

19、
　　2.4、ELISA結果顯示，OGD處理后，BV2細胞的細胞因子(IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6)表達明顯升高，然而，我們發(fā)現不管是抑制細胞的NLRP3還是NOX2的表達，OGD處理后的BV2細胞因子含量都較Scramble處理組和正常細胞處理組有顯著地降低。
　　3、神經元與BV2細胞共培養(yǎng)實驗
　　通過建立Transwell共培養(yǎng)模型，我們得出在OGD過程中，BV2細胞對神經元有毒性作用。通過轉染

20、分別抑制BV2細胞NLRP3或NOX2的表達，再次與神經元共培養(yǎng)，結果顯示BV2細胞對神經元的毒性作用有所減弱。
　　第三部分:內皮細胞在NLRP3介導下加重缺血再灌注損傷的機制
　　1、OGD模型建立
　　建立不同時間點的OGD處理模型，通過WesternBlot分析，我們檢測到bEND.3細胞中NLRP3、Caspase-1、MMP2/9表達在OGD后有顯著升高，而ZO-1、TJP-2則出現降低趨勢。
　　2

21、、對轉染shRNA-NLRP3的bEND.3細胞進行OGD處理，隨后檢測相關分子的變化
　　通過轉染shRNA-NLRP3抑制bEND.3細胞NLRP3的表達，并對細胞進行OGD處理，我們檢測到細胞MMP2/9和相關細胞因子的升高程度被抑制，而ZO-1、TJP-2的降低趨勢也較對照組有所緩和。
　　3、體外內皮細胞通透性實驗
　　通過體外內皮細胞通透性實驗我們發(fā)現，OGD處理后內皮細胞通透能力顯著增高，但是抑制內皮細胞

22、NLRP3表達后，內皮細胞通透性增高水平有所降低。
　　4、IL-1β對內皮細胞通透性的影響
　　經過IL-1β處理后，內皮細胞通透性升高，MMP2/9表達增高，ZO-1、TJP-2含量降低。
　　第四部分:缺血再灌注損傷中NADPH氧化酶對NLRP3通路的調控作用
　　建立缺血再灌注模型，通過MRI平掃，我們發(fā)現NOX2缺失后，再灌注腦損傷的面積明顯縮小，同時腦水腫程度也有所減輕。通過WesternBlot分析

23、得出，缺血再灌注損傷過程中NOX2缺乏可以使NLRP3表達下降，進而影響到整個NLRP3通路。
　　結論:
　　1、體內實驗證明，NLRP3的缺乏可以使腦梗死損傷程度減輕，血腦屏障功能得到保護，進而減輕缺血再灌注后的小鼠腦損傷程度。
　　2、我們進一步發(fā)現，在缺血再灌注損傷過程中，NLRP3引起的腦損傷與其介導產生的細胞因子通過自分泌和旁分泌模式作用于血管神經單元有關。體外實驗中，NLRP3炎性體介導的小膠質細胞的神經