FGFR3在小鼠小腸缺血再灌注損傷修復(fù)中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、腸粘膜屏障損害導(dǎo)致細(xì)菌易位、腸源性感染，在多臟器功能衰竭中起重要作用。腸缺血再灌注損傷是腸粘膜屏障功能損害的常見(jiàn)原因。因此，加強(qiáng)腸粘膜的修復(fù)，預(yù)防或減輕腸屏障功能損害，對(duì)膿毒癥和MODS的防治具有非常重要的意義，但迄今這方面還沒(méi)有有效的治療方法。 缺血/再灌注(I/P)損傷后的腸屏障功能恢復(fù)與腸上皮細(xì)胞和腸血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān)，而腸上皮細(xì)胞凋亡在腸缺血再灌注損傷中起重要作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的成纖維細(xì)胞因子是對(duì)腸上皮生長(zhǎng)和

2、功能有重要調(diào)節(jié)作用的多肽，他們通過(guò)與其受體結(jié)合激活酪氨酸激酶活性，引起受體的自磷酸化隨后進(jìn)入不同的信號(hào)傳遞途徑發(fā)揮作用，而成纖維細(xì)胞因子受體在胃腸道的生物學(xué)活性卻少有報(bào)道。有研究提示FGFR3參與放射損傷后的修復(fù)。而絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鞯郊?xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者。MAPK具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、死亡等多種細(xì)胞生理過(guò)程的作用，其亞類細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)信號(hào)傳導(dǎo)通路是多種細(xì)胞外有絲分裂信號(hào)引

3、起細(xì)胞增殖的共同通路，與細(xì)胞增殖有密切關(guān)系。 本文擬觀察野生小鼠及FGFR3增強(qiáng)小鼠小腸發(fā)育階段的特點(diǎn)和FGFR3表達(dá)變化。另外采用小腸缺血再灌注模型，觀察野生小鼠及FGFR3增強(qiáng)小鼠小腸粘膜缺血再灌注損傷及再生修復(fù)的特征及規(guī)律，以及腸上皮細(xì)胞增殖、凋亡的情況，檢測(cè)I/R損傷后小腸FGFR3的基因表達(dá)與其對(duì)傷后腸上皮細(xì)胞ERKl/2活性的影響，從而確定FGFR3在介導(dǎo)腸上皮損傷修復(fù)中的作用，探討FGFR3促進(jìn)I/R損傷后腸上皮細(xì)

4、胞修復(fù)的分子機(jī)制。最終為尋找促進(jìn)腸上皮細(xì)胞損傷修復(fù)，防止腸屏障功能損害的新方法提供理論依據(jù)。 第一部分 FGFR3在小鼠小腸發(fā)育階段的作用 主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法如下： 動(dòng)物：Fgfr3369/+基因工程小鼠及C57BL/6J小鼠。 1.組織學(xué)方法觀察同窩增強(qiáng)突變小鼠與野生小鼠出生后第1、7、14、21、28、35天腸上皮發(fā)育過(guò)程中的組織形念學(xué)和掃描電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)變化。 2.腸上皮增殖能力檢測(cè)：用溴

5、脫氧尿苷(BrdUrd)標(biāo)記7、14、21、28、35天兩組小鼠小腸上皮S期細(xì)胞(方法：按100ug/g(體重)劑量腹腔注射，2小時(shí)后取材)，免疫組化(SABC法)檢測(cè)其陽(yáng)性表達(dá)情況。 3.免疫組化(SABC法)檢測(cè)兩組小鼠小腸組織FGFR3的表達(dá)情況。 4.提取1、7、14、21、28、35天兩組小鼠小腸組織RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳半定量檢測(cè)FGFR-3在各時(shí)相的表達(dá)水平。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

6、 1.突變小鼠絨毛分布密度及絨毛高度均差于同年齡野生小鼠，但隱窩深度卻是相反的。 2.增生的細(xì)胞主要位于腸隱窩部位，F(xiàn)GFR3增強(qiáng)突變小鼠在各時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞增殖均強(qiáng)于野生小鼠。 3.小鼠出生后1天小腸即有FGFR3表達(dá)，7-21天表達(dá)較多，35天后表達(dá)減少。免疫組化檢測(cè)FGFR3表達(dá)位于腸隱窩部位，與Brdu表達(dá)信號(hào)部位相重疊。 第二部分 FGFR3在小鼠小腸缺血再灌注損傷修復(fù)中的作用及機(jī)制 主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

7、及方法如下： 1.動(dòng)物模型制備及分組：取6-8周齡小鼠，分為正常組、野生鼠I/R組和FGFR3增強(qiáng)小鼠I/R組，每組6只。術(shù)前12h禁食，自由飲水。用0.6％的戊巴比妥鈉(60mg/kg體重)腹腔注射麻醉，暴露腸系膜上動(dòng)脈(SMA)，無(wú)創(chuàng)血管阻斷劑夾閉1h后松開形成再灌注。 2.標(biāo)本采集、分離與儲(chǔ)存：正常組直接活殺，另兩組動(dòng)物分別于松夾后1、3、6h和1、3d活殺?？綮o脈竇采血，使用肝素抗凝，充分混合，以3000rpm離

8、心10min后貯存于-20℃冰箱中，用以檢測(cè)血漿D-乳酸，使用美國(guó)Thermo LabsystemsMultiskan Spectrum全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)340 nm)檢測(cè)。選擇近端空腸，一部分腸管用4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，用以檢測(cè)小腸組織PCNA表達(dá)及凋亡情況；另一部分腸管立即放入-80℃冰箱凍存，用以檢測(cè)小腸組織FGFR3mRNA表達(dá)及MAPK活性檢測(cè)。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.腸缺血再灌注1、3、6h，腸粘膜

9、損害明顯，再灌注1d、3d組，腸粘膜結(jié)構(gòu)恢復(fù)至正常。FGFR3增強(qiáng)小鼠在各時(shí)間點(diǎn)腸粘膜損害程度均輕于野生小鼠。 2.腸缺血再灌注1、3、6h，粘膜上皮細(xì)胞凋亡增加，再灌注1d、3d組腸粘膜上皮細(xì)胞凋亡明顯減少，F(xiàn)GFR3增強(qiáng)小鼠在各時(shí)間點(diǎn)凋亡程度均輕于野生小鼠。 3.腸缺血再灌注1、3、6h，粘膜隱窩上皮細(xì)胞增殖增多，再灌注Id、3d組粘膜隱窩上皮細(xì)胞增殖活性逐漸降低， FGFR3增強(qiáng)小鼠在各時(shí)間點(diǎn)增殖能力明顯強(qiáng)于野生小

10、鼠。 4.兩組小鼠缺血再灌注損傷后各時(shí)相點(diǎn)，血漿D-乳酸水平均明顯高于正常對(duì)照組小鼠，并且均在再灌注th后達(dá)到峰值，然后逐漸下降。但FGFR3增強(qiáng)小鼠在再灌注1、3、6h，D-乳酸水平均顯著低于野生小鼠。 5.兩組小鼠缺血再灌注損傷后FGFR3mRNA表達(dá)明顯增高，均在再灌注th后達(dá)到第一個(gè)峰值，然后迅速下降，于3h達(dá)到低谷，再迅速升高達(dá)到第二個(gè)峰值后逐漸下降，3d仍處于較高水平。 6.兩組小鼠的Erk在各時(shí)間點(diǎn)