NALP3炎癥小體參與小鼠肝臟缺血再灌注損傷的作用及其機(jī)制.pdf

1、缺血再灌注過程可釋放多種激活炎癥小體的啟動因子，故推測炎癥小體可能參與缺血再灌注損傷。文獻(xiàn)已報(bào)道：炎癥小體激活所釋放IL-1β和IL-18在小鼠LIRI中是重要的啟動因子，某些針對IL-1β和IL-18的治療策略顯示較好療效；IL-1β在缺血再灌注損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用，IL-1β基因敲除小鼠能明顯減緩缺血再灌注損傷；IL-1受體拮抗基因敲除小鼠缺血再灌注損傷明顯加重。本課題建立小鼠LIRI動物模型，并構(gòu)建針對小鼠NALP3的干擾質(zhì)粒，觀察

2、NALP3炎癥小體參與LIRI的作用，并初步探討其機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：NALP3炎癥小體在小鼠肝臟缺血再灌注所致無菌性炎癥及組織損傷中起重要作用，其機(jī)制為：NALP3炎癥小體參與IL-1β和IL-18等細(xì)胞因子成熟、釋放；NALP3炎癥小體參與肝臟細(xì)胞凋亡及炎性細(xì)胞浸潤。本課題所獲研究成果為臨床上探索防治LIRI的策略提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 一、NALP3炎癥小體參與小鼠LIRI 建立雄性C57/BL小鼠LIRI模型，同時(shí)設(shè)立假

3、手術(shù)對照組。 1.小鼠LIR后血清ALT/AST變化及肝臟形態(tài)學(xué)改變小鼠肝臟缺血1h再灌注6h后收集血清檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）變化，同時(shí)制作肝臟石蠟切片，H&E染色觀察形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果顯示：模型組ALT/AST明顯高于假手術(shù)組，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)模型組出現(xiàn)大量肝細(xì)胞變性、凋亡、壞死及炎性細(xì)胞浸潤。提示小鼠肝臟缺血再灌注損傷模型制作成功。2.小鼠LIR后不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β水平分別采集小鼠肝臟缺血1h再灌注1h、3h、

4、6h及24h后血樣，ELISA檢測IL-1β水平。結(jié)果顯示：與假手術(shù)對照組相比，血清IL-1β在1h后開始升高，6h達(dá)高峰，24h后回落至1h水平(p<0.05)。3.小鼠LIR后不同時(shí)間點(diǎn)NALP3蛋白表達(dá)小鼠肝臟缺血1h再灌注6h、12h及24h后分別取小鼠肝臟組織，免疫印記與IL-1β大量釋放相關(guān)。缺血再灌注過程可釋放多種激活炎癥小體的啟動因子，如鈣聚集、鉀離子外流、ROS及多種危險(xiǎn)信號（如HMGB1、DNA及RNA）等，故推測炎

5、癥小體可能參與缺血再灌注損傷。文獻(xiàn)已報(bào)道：炎癥小體激活所釋放IL-1β和IL-18在小鼠LIRI中是重要的啟動因子，某些針對IL-1β和IL-18的治療策略顯示較好療效；IL-1β在缺血再灌注損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用，IL-1β基因敲除小鼠能明顯減緩缺血再灌注損傷；IL-1受體拮抗基因敲除小鼠缺血再灌注損傷明顯加重。迄今，有關(guān)NALP3炎癥小體是否參與肝臟缺血再灌注損傷，以及干預(yù)NALP3對小鼠肝臟缺血再灌注損傷的影響，均尚未見報(bào)道。本課題建

6、立小鼠LIRI動物模型，并構(gòu)建針對小鼠NALP3的干擾質(zhì)粒，觀察NALP3炎癥小體參與LIRI的作用，并初步探討其機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：NALP3炎癥小體在小鼠肝臟缺血再灌注所致無菌性炎癥及組織損傷中起重要作用，其機(jī)制為：NALP3炎癥小體參與IL-1β和IL-18等細(xì)胞因子成熟、釋放；NALP3炎癥小體參與肝臟細(xì)胞凋亡及。
　　 本課題所獲研究成果為臨床上探索防治LIRI的策略提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 一、NALP3炎癥小

7、體參與小鼠LIRI 建立雄性C57/BL小鼠LIRI模型，同時(shí)設(shè)立假手術(shù)對照組。
　　 1.小鼠LIR后血清ALT/AST變化及肝臟形態(tài)學(xué)改變小鼠肝臟缺血1h再灌注6h后收集血清檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）變化，同時(shí)制作肝臟石蠟切片，H&E染色觀察形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果顯示：模型組ALT/AST明顯高于假手術(shù)組，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)模型組出現(xiàn)大量肝細(xì)胞變性、凋亡、壞死及炎性細(xì)胞浸潤。提示小鼠肝臟缺血再灌注損傷模型制作成功。

8、2.小鼠LIR后不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β水平分別采集小鼠肝臟缺血1h再灌注1h、3h、6h及24h后血樣，ELISA檢測IL-1β水平。結(jié)果顯示：與假手術(shù)對照組相比，血清IL-1β在1h后開始升高，6h達(dá)高峰，24h后回落至1h水平(p<0.05)。3.小鼠LIR后不同時(shí)間點(diǎn)NALP3蛋白表達(dá)小鼠肝臟缺血1h再灌注6h、12h及24h后分別取小鼠肝臟組織，免疫印記法檢測NALP3蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與假手術(shù)組對照，小鼠缺血1h再灌注后NAL

9、P3蛋白開始上調(diào)，持續(xù)到12h，以6h最為明顯(p<0.05)。4.小鼠肝臟缺血再灌注損傷后ROS變化小鼠肝臟缺血1h再灌注6h后分離非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，DCF染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS含量。結(jié)果顯示，與假手術(shù)對照組相比，缺血1h再灌注6h后ROS明顯增高。以上結(jié)果提示，NALP3炎癥小體參與小鼠LIRI過程。
　　 二、NALP3基因干擾載體的構(gòu)建及鑒定
　　 1.針對小鼠NALP3基因干擾序列的篩選利用siRNA設(shè)計(jì)軟件篩選

10、針對小鼠NALP3基因的3條干擾序列及1條無關(guān)序列，分別合成并命名為siRNA1(S1)，siRNA2(S2)，siRNA3(S3)及scramble siRNA，利用脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，Western-blot檢測目的蛋白NALP3沉默效果，發(fā)現(xiàn)siRNA3沉默效果最佳，scramble siRNA無明顯影響。故選擇siRNA3序列為NALP3有效干擾序列。2.特異性pNALP3shRNA干擾載體的構(gòu)建及鑒定分別將siR

11、NA3特異性干擾序列及scramble siRNA無關(guān)序列構(gòu)建入干擾載體pNALP3shRNA及pshRNANC中，經(jīng)酶切鑒定及測序驗(yàn)證其正確性。利用小鼠巨噬細(xì)胞核轉(zhuǎn)試劑盒分別轉(zhuǎn)染pNALP3shRNA和pshRNANC至巨噬細(xì)胞，設(shè)立mock組對照。熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測NALP3 mRNA水平，Western blot檢測其蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pNALP3shRNA干擾載體能特異性沉默NALP3基因 (p<0.05)，而對其他相關(guān)基

12、因（NALP1b、NLRC4等）無影響。提示pNALP3shRNA干擾載體具有沉默特異性。3.pNALP3shRNA干擾載體對巨噬細(xì)胞分泌IL-1β的影響利用小鼠巨噬細(xì)胞核轉(zhuǎn)試劑盒轉(zhuǎn)染pNALP3shRNA和pshRNANC至巨噬細(xì)胞，設(shè)mock組對照。48h后繼續(xù)給予LPS及ATP刺激，檢測上清IL-1β含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pNALP3shRNA組IL-1β含量明顯降低 (p<0.05)。
　　 三、沉默NALP3基因?qū)π∈驦

13、IRI的影響及其機(jī)制
　　 1.體內(nèi)干擾NALP3基因?qū)π∈驦IRI的保護(hù)作用（1）pNALP3shRNA對小鼠肝臟的沉默效果尾靜脈高壓注射pNALP3shRNA質(zhì)粒后48h，制作小鼠缺血1h再灌注6h動脈模型，實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot、免疫組化及流式細(xì)胞術(shù)檢測肝組織NALP3表達(dá)。結(jié)果表明：與生理鹽水及pshRNANC組相比，pNALP3shRNA組NALP3表達(dá)明顯下降；免疫組化顯示NALP3主要表達(dá)于肝臟K

14、upffer細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，Kupffer細(xì)胞和肝竇狀內(nèi)皮細(xì)胞NALP3表達(dá)均被抑制。（2）pNALP3shRNA預(yù)處理對小鼠缺血再灌注損傷后肝功能的影響小鼠肝臟缺血1h再灌注6h、12h及24h后收集血清及肝組織制作切片。檢測ALT/AST水平及H&E染色。
　　 結(jié)果表明：與生理鹽水及pshRNANC對照組相比，pNALP3shRNA組血清ALT/AST水平明顯降低 (p<0.01)，H&E染色顯示肝

15、細(xì)胞變性壞死及炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。提示pNALP3shRNA預(yù)處理小鼠能明顯減輕肝臟缺血再灌注損傷。2.沉默NALP3基因?qū)π∈驦IRI保護(hù)作用的可能機(jī)制（1）pNALP3shRNA預(yù)處理對小鼠LIRI后血清IL-1β、IL-18水平的影響小鼠缺血1h再灌注6h后，血清IL-1β和IL-18水平均升高；pNALP3shRNA預(yù)處理能明顯降低血清IL-1β和IL-18水平 (p<0.05)，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)pNALP3s

16、hRNA預(yù)處理能降低活化的Caspase-1水平。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，pNALP3-shRNA能抑制巨噬細(xì)胞分泌IL-1β(p<0.05)。（2）pNALP3shRNA對小鼠血清細(xì)胞因子及HMGB1水平的影響與生理鹽水及pshRNANC對照組相比，pNALP3shRNA預(yù)處理組小鼠缺血1h再灌注6h后血清TNF-α和IL-6水平明顯減低，同時(shí)肝組織HMGB1表達(dá)明顯降低 (p<0.05)。再灌注后1h提取肝臟核蛋白，凝膠遷移率(EMSA)實(shí)驗(yàn)

17、檢測NF-κB的DNA結(jié)合活性，結(jié)果顯示，pNALP3shRNA組NF-κB活性明顯減低(p<0.05)。（3）pNALP3shRNA對小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響小鼠缺血1h再灌注6h后，切取肝組織，4％多聚甲醛固定，制作石蠟切片，TUNEL法檢測肝細(xì)胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組及pshRNANC組對比，pNALP3shRNA預(yù)處理能明顯減輕小鼠缺血1h再灌注6h后肝細(xì)胞凋亡(p<0.05)。（4）pNALP3shRNA對小鼠肝臟巨噬細(xì)胞及

18、中性粒細(xì)胞浸潤的影響小鼠缺血1h再灌注6h后，切取肝組織，4％多聚甲醛固定，制作石蠟切片，免疫組化檢測巨噬細(xì)胞(F4/80)和中性粒細(xì)胞(Gr-1)浸潤。
　　 四、結(jié)論
　　 1.NALP3 炎癥小體參與小鼠LIRI發(fā)生、發(fā)展。2.pNALP3shRNA預(yù)處理能保護(hù)小鼠肝臟缺血再灌注損傷。3.上述保護(hù)作用的可能機(jī)制為：抑制炎性因子IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6及HMGB1釋放；抑制NF-κB活性；減少肝細(xì)