長期的標(biāo)志保留細(xì)胞在小鼠缺血再灌注腎臟損傷修復(fù)過程中的作用.pdf

1、目的：
　　1.觀察成年小鼠腎臟缺血再灌注損傷后是否具有一定的組織自身修復(fù)能力;
　　2.明確成年小鼠腎臟是否存在其新生時標(biāo)記的LRCs及其分布位置和特征;
　　3.探討腎臟固有的長期標(biāo)記的LRCs是否參與急性腎臟損傷后腎臟自身修復(fù)過程及其作用;明確其是否可以被認(rèn)為是真正的成體腎臟干細(xì)胞或祖細(xì)胞壁龕。
　　方法：
　　1.長期BrdU標(biāo)記小鼠的模型構(gòu)建。為標(biāo)記長期的腎臟固有LRCs，本文在出生后12小時的新

2、生C57BL/6J小鼠腹腔內(nèi)注射BrdU（50μg/g），每天2次，連續(xù)注射3天。此后，這些新生小鼠在沒有任何醫(yī)療操作的情況下生長至8周齡。
　　2.成年小鼠腎臟缺血再灌注的模型構(gòu)建。文章選取在新生已標(biāo)記BrdU的8周齡雄性C57BL/6J小鼠，并隨機(jī)分為以下各組:假手術(shù)組(n=30)，腎臟缺血再灌注組(n=40)。實(shí)驗(yàn)處理如下:小鼠使用水合氯醛麻醉后，打開動物腹腔，使用無創(chuàng)性的微血管夾夾閉雙側(cè)腎血管22分鐘，然后去除微血管夾，觀

3、察腎臟再灌注情況，關(guān)腹后注射預(yù)溫37℃生理鹽水1ml以補(bǔ)充手術(shù)過程中體液的丟失。假手術(shù)組動物行開腹手術(shù)后，游離雙側(cè)腎蒂組織，但不進(jìn)行腎血管夾閉，隨后關(guān)腹。整個手術(shù)操作過程中，小鼠身體保持在一個37℃恒溫電熱毯上。分別于手術(shù)后1d、2d、3d、4d、5d、6d、9d、14d、28d處死小鼠，采集血液及心肝腎臟組織。
　　3.腎臟功能評估。處死小鼠前留取血液標(biāo)本，利用臨床生化室儀器檢測血清中尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)。
　　

4、4.腎臟病理檢測。腎臟組織采用常規(guī)HE染色，通過顯微鏡觀察小鼠腎臟缺血再灌注術(shù)后成體腎臟損傷修復(fù)的組織形態(tài)學(xué)變化。腎臟組織采用免疫組織化學(xué)染色來計數(shù)定位LRCs。除利用常規(guī)的免疫組織化學(xué)染色技術(shù)定位成體小鼠腎臟BrdU標(biāo)記的LRCs外，為了更準(zhǔn)確清晰的計數(shù)BrdU標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)中部分免疫組織化學(xué)染色標(biāo)本未進(jìn)行常規(guī)的蘇木素細(xì)胞核染色。每張病理標(biāo)本在200倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)視野中BrdU陽性細(xì)胞核數(shù)，取其平均值計量為BrdU陽性細(xì)

5、胞數(shù)量。
　　5.雙色免疫熒光檢測。采用腎臟組織冰凍切片進(jìn)行免疫熒光檢測，使用熒光顯微鏡觀察并攝影羅丹明、FITC標(biāo)記的熒光二抗，從而間接檢測腎臟組織中BrdU及Ki-67、BrdU及TUNEL、BrdU及LAT的表達(dá)。DAPI用于標(biāo)記腎臟組織細(xì)胞核位置。
　　6.統(tǒng)計學(xué)處理。服從正態(tài)分布的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)的方式表示，使用統(tǒng)計軟件SPSS16.0處理，采用單因素方差分析進(jìn)行組間均數(shù)的比較，P＜0.05被

6、認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.成年小鼠腎臟缺血再灌注損傷后腎組織恢復(fù)情況
　　1.1腎臟功能恢復(fù)情況
　　與假手術(shù)組相比，腎臟缺血再灌注組小鼠Scr、BUN在術(shù)后1天內(nèi)顯著升高，于術(shù)后24小時達(dá)到高峰。與術(shù)后基線相比，Scr值在術(shù)后24小時末約升高9倍(24小時末Scr vs術(shù)后基線Scr:175.93±36.61 umol/l vs19.53±5.03 umol/l，p＜0.05)，此后Scr值逐漸

7、降低，到術(shù)后第9天恢復(fù)正常水平。BUN值變化趨勢基本與Scr值一致。
　　1.2腎臟組織形態(tài)學(xué)恢復(fù)情況
　　為了更直觀的反應(yīng)腎臟缺血再灌注損傷后組織修復(fù)再生情況，我們進(jìn)行了腎臟病理HE染色。病理切片顯示術(shù)后24小時小鼠腎臟組織可以觀察到典型的腎小管損傷，這些典型的損傷在術(shù)后第3天仍然可以觀察到，分布在腎臟組織的皮質(zhì)、髓質(zhì)，甚至腎乳頭部。但是，在術(shù)后第4天，病理切片上可以明顯地觀察到新生小管細(xì)胞大量增殖，這些新生的聚集細(xì)胞趨向

8、于形成一種特殊的類似于細(xì)胞壁龕樣(the special niches-like structure)的結(jié)構(gòu)。在接來下的3～5天內(nèi)，腎臟組織結(jié)構(gòu)快速恢復(fù)，腎小管擴(kuò)張、小管上皮細(xì)胞崩潰脫落、管腔內(nèi)刷狀緣消失、管腔基底膜裸露等典型腎小管損傷明顯減少。術(shù)后第9天，腎臟皮髓質(zhì)及乳頭部結(jié)構(gòu)開始趨向正常。
　　2.成年小鼠腎臟長期標(biāo)記的LRCs分布
　　2.1成年小鼠長期標(biāo)記的LRCs分布位置及形態(tài)
　　新生小鼠體內(nèi)標(biāo)記BrdU8

9、周后，成年小鼠腎臟內(nèi)可以觀察到零散分布的BrdU+ LRCs。大多數(shù)的LRCs分布在腎小管細(xì)胞，少量的LRCs分布在腎組織間質(zhì)，其中有一部分LRCs是成對出現(xiàn)的;這些成對出現(xiàn)的LRCs約占其總量的21.7±1.5％。另外，我們觀察到在成年小鼠腎臟內(nèi)長期標(biāo)記的BrdU+LRCs的細(xì)胞核形態(tài)學(xué)特征并不一致，其中一些表現(xiàn)出核碎裂和核溶解現(xiàn)象，約占LRCs總量的10.1±0.9％。
　　2.2成鼠腎臟缺血再灌注損傷后長期標(biāo)記的LRCs分布

10、位置及計數(shù)
　　與假手術(shù)組比較，被標(biāo)記有BrdU的雄性8周齡腎臟缺血再灌注組的小鼠腎組織內(nèi)BrdU+LRCs的數(shù)量隨腎功能恢復(fù)而逐漸減少。其中術(shù)后第4天LRCs的數(shù)量減少最為顯著，在腎皮質(zhì)、髓質(zhì)及腎乳頭部分別減少85±2％，81±5％及95±5％。在術(shù)后第28天，腎組織內(nèi)BrdU+LRCs很難被檢測到。
　　3.長期標(biāo)記的LRCs中只有部分細(xì)胞積極參與到成鼠腎臟缺血再灌注損傷修復(fù)過程中
　　術(shù)后第4天，腎臟缺血再灌注小

11、鼠的腎組織內(nèi)可見大量腎小管細(xì)胞增殖，同時損傷壞死的腎小管明顯減少。在這個損傷修復(fù)階段，本文用Ki-67抗體標(biāo)記新增殖的細(xì)胞、用TUNEL抗體標(biāo)記凋亡壞死細(xì)胞。腎臟病理冰凍切片免疫熒光顯示Ki-67標(biāo)記的新增殖的細(xì)胞形成一種類似于壁龕樣的特殊結(jié)構(gòu)，這一結(jié)果與腎臟病理HE染色觀察結(jié)果一致。但是，并不是所有的BrdU+ LRCs都位于這個結(jié)構(gòu)內(nèi)，只有那些成對出現(xiàn)的LRCs才趨向于與Ki-67共表達(dá)。另外，免疫熒光結(jié)果顯示部分零散分布的LRCs

12、趨向于與TUNEL共表達(dá)。
　　4.成鼠腎臟缺血再灌注損傷修復(fù)過程中長期標(biāo)記的LRCs生物學(xué)特點(diǎn)
　　為了進(jìn)一步明確成鼠腎臟LRCs的分化特征，本文選取了近端腎小管分化成熟標(biāo)記物L(fēng)TA，以研究LRCs分化程度，并判斷其是否真正具有腎臟干細(xì)胞或祖細(xì)胞性質(zhì)。雙色免疫熒光結(jié)果顯示損傷早期及正常成鼠腎組織可觀察到一些零散分布的BrdU+LRCs與成熟的近端小管標(biāo)志物L(fēng)TA共表達(dá)，然而有趣的是，那些成對分布的BrdU+LRCs并未與L

13、TA共表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.本研究通過小鼠缺血再灌注模型證實(shí)成鼠急性腎損傷后具有自身修復(fù)再生能力，并發(fā)現(xiàn)損傷后大量新生的腎小管細(xì)胞趨向于聚集形成一種類似于壁龕樣的結(jié)構(gòu)以促進(jìn)受損腎組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)。
　　2.本研究結(jié)果證實(shí)成年小鼠腎臟存在零散分布的少量長期標(biāo)記的LRCs，其中只有部分LRCs積極參與到成年小鼠腎臟急性損傷修復(fù)過程中。這部分LRCs主要表現(xiàn)為在損傷后新增生的細(xì)胞中成對出現(xiàn)。
　　3.本研究首次發(fā)現(xiàn)長

14、期標(biāo)記的LRCs細(xì)胞核形態(tài)呈現(xiàn)多樣性，有的甚至表現(xiàn)出核碎裂和核溶解。在小鼠腎臟急性腎損傷修復(fù)的同一階段其細(xì)胞表型也不一致。因此，文章認(rèn)為成鼠腎臟中長期標(biāo)記的LRCs不是單純的一種細(xì)胞;并提示在應(yīng)用其尋找定位腎臟固干細(xì)胞的研究中，其生物學(xué)特性的復(fù)雜性應(yīng)該被充分重視。
　　4.本研究顯示在小鼠腎臟缺血再灌注損傷后，早期修復(fù)出現(xiàn)前，長期標(biāo)記的LRCs有的已呈現(xiàn)終末分化狀態(tài)，進(jìn)一步證實(shí)并不是腎臟全部的LRCs都可以被認(rèn)為是慢周期細(xì)胞來定位