端粒酶在腎臟的表達(dá)及其在腎臟缺血再灌注損傷修復(fù)過(guò)程中的作用研究.pdf

1、目的：端粒酶可以維持端粒體長(zhǎng)度，防止細(xì)胞衰老，在胚胎干細(xì)胞中高度表達(dá)，但除部分成體干細(xì)胞(如造血干細(xì)胞)外，成年體細(xì)胞內(nèi)幾乎已無(wú)端粒酶的表達(dá)。我們利用已報(bào)道的端粒酶基因啟動(dòng)的GFP轉(zhuǎn)基因鼠(mTert-GFP)研究端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞在腎臟的表達(dá)和腎損傷后變化，并求證端粒酶陽(yáng)性表達(dá)能否成為腎臟成體干細(xì)胞的標(biāo)志，進(jìn)一步明確急性腎損傷修復(fù)的機(jī)制，以尋求指導(dǎo)急性腎損傷治療的理論基礎(chǔ)。
　　 方法：(一)利用mTert-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)

2、腎小管標(biāo)記物(AQP1、AQP2、THP、DBA及NKCC2等)和腎間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(F4/80、CD31、NG2及PDGFR-beta等)熒光共染定位端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞(GFP+)；通過(guò)real-time PCR和TRAP(Telomeric Repeat Amplification Protocol)PCR Elisa定量檢測(cè)端粒酶基因和酶活性；(二)給新生mTert-GFP小鼠腹腔注射BrdU標(biāo)記S期細(xì)胞，待8周成年后處死，仍保留Brd

3、U標(biāo)記的細(xì)胞為進(jìn)入緩慢細(xì)胞周期的細(xì)胞Label-retaining Cells(LRC)，觀察并計(jì)數(shù)；(三)10周齡雄性FVB小鼠24只，夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈30min，再通，制作小鼠雙側(cè)腎動(dòng)脈缺血再灌注損傷(I/R)模型，分為假手術(shù)組(sham)、術(shù)后1天、2天、3天共4組，每組6只，分別取腎標(biāo)本，同樣用PCR和TRAP法檢測(cè)腎損傷修復(fù)過(guò)程中端粒酶基因和酶活性的變化；(四)利用mTert-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，建立單側(cè)腎臟I/R模型，并在術(shù)后腎

4、損傷再修復(fù)過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)觀察mTert-GFP再生情況；(五)利用mTert-CreERt2；R26LacZ兩種轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)譜系追蹤和細(xì)胞周期標(biāo)記研究腎缺血再灌注損傷修復(fù)過(guò)程中mTert細(xì)胞的再生和遷移。
　　 結(jié)果：(一)生理狀態(tài)下，端粒酶基因主要表達(dá)在成年小鼠腎臟乳頭和內(nèi)髓部位，保持較高的酶活性。成年mTert-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的腎臟mTert表達(dá)與GFP保持一致，端粒酶主要表達(dá)于集合管和髓袢的小管上皮細(xì)胞(即AQP1

5、、AQP2、THP、NKCC2陽(yáng)性的小管)，而在近曲小管和間質(zhì)沒(méi)有表達(dá)。(二)觀察BrdU標(biāo)記的腎乳頭，16.7％的細(xì)胞長(zhǎng)期保留BrdU標(biāo)記，僅5％GFP+細(xì)胞仍有BrdU標(biāo)記，視為進(jìn)入慢細(xì)胞周期的LRC，這些細(xì)胞也散在分布于集合管和髓袢。(三)mTert基因于腎損傷后48h在腎乳頭的表達(dá)明顯上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但在髓質(zhì)和皮質(zhì)的表達(dá)無(wú)顯著變化。雙側(cè)腎損傷后24h和48h，腎乳頭處端粒酶活性也顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0

6、.05)。(四)為證明急性腎損傷后端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞的作用，IRI刺激后24h、48h和72h分別給予BrdU，發(fā)現(xiàn)僅0.3％-0.5％的GFP+細(xì)胞增殖，且損傷最嚴(yán)重的外髓和皮質(zhì)未出現(xiàn)GFP+細(xì)胞顯著增加。(五)為追蹤mTert+上皮細(xì)胞在I/R后的命運(yùn)，術(shù)前一周給成年mTert-CreERt2；R26LacZ鼠單劑tamoxifen，術(shù)后連續(xù)5天給予BrdU，發(fā)現(xiàn)mTert-LacZ細(xì)胞未出現(xiàn)明顯增殖和遷移，mTert+細(xì)胞也并未標(biāo)記B