心肌組織氧代謝在小鼠急性心肌缺血再灌注損傷中的作用及相關(guān)機制研究.pdf

1、第一部分
　　 背景及目的：
　　 目前，心肌缺血性疾病的患病率和致死率依然非常顯著。血流再灌注心肌時可防止心肌進一步梗死面積擴大，然而經(jīng)過較長時間的缺血后心肌再灌注也會給帶來逆轉(zhuǎn)的損傷，這一現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷。防治再灌注引起的心肌損傷成為心血管研究重點之一。冠狀動脈多次短暫的缺血可以是心肌對隨后而來較長時間的缺血耐受性增強，稱為缺血預(yù)適應(yīng)，能有效地保護心肌減少缺血再灌注損傷。缺血預(yù)適應(yīng)分為早期保護和延遲保護兩個時相

2、，而延遲相保護出現(xiàn)較晚但保護時間較長，成為研究熱點。眾多延遲相缺血預(yù)適應(yīng)保護機制得到研究闡明，然而對于其在缺血再灌注損傷中氧代謝的調(diào)節(jié)機制不甚明了。我們前期對缺血再灌注小鼠模型研究實驗中，利用電子順磁共振監(jiān)測心肌內(nèi)氧含量變化及激光多普勒血流監(jiān)測儀監(jiān)測心肌血流灌注分析發(fā)現(xiàn)心肌再灌注后產(chǎn)生超過缺血前基線Po2的高氧狀態(tài)。而內(nèi)皮誘導(dǎo)產(chǎn)生的一氧化氮及其衍生物調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈酶從而抑制線粒體氧消耗是其產(chǎn)生的重要機制之一。在本次實驗中，我們將探明在

3、小鼠心肌缺血再灌注模型中，延遲相缺血預(yù)適應(yīng)是否通過調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈酶從而保護線粒體功能而改善缺血后心肌的高氧狀態(tài)。
　　 實驗方法：
　　 建立C57小鼠心肌缺血再灌注模型。給予冠狀動脈左前降支30min缺血，60min再灌注。所有動物隨機分為四組（每組6只）：（1）假手術(shù)組：開胸，不結(jié)扎干預(yù)；（2）延遲相缺血預(yù)適應(yīng)組：反復(fù)結(jié)扎開放前降支3次，每次缺血5min，再灌注5min，24h后開胸假手術(shù)，不做缺血再灌注處理；（3

4、）缺血再灌注組：左前降支結(jié)扎缺血30min，再灌60min；（4）延遲相缺血預(yù)適應(yīng)治療組：反復(fù)結(jié)扎開放前降支3次，每次缺血5min，再灌注5min，24h后開胸左前降支缺血30min，再灌60min。
　　 在缺血前，缺血中，及再灌注中利用電子順磁共振儀監(jiān)測心肌組織氧含量，利用激光多普勒血流監(jiān)測儀監(jiān)測心肌組織血流灌注情況；實驗結(jié)束后，測量心肌缺血面積及梗死面積，檢測心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性及蛋白表達水平，檢測SODs蛋白表達水

5、平；最后進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)論：
　　 延遲相缺血預(yù)適應(yīng)能通過上調(diào)Mn-SOD表達及線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性和蛋白表達來增加線粒體對缺血再灌注損傷的耐受性，從而抑制心肌灌注的高氧狀態(tài)，保護心肌細胞，減少梗死面積。
　　 缺血再灌注損傷；延遲相缺血預(yù)適應(yīng)；線粒體；電子順磁共振；活性氧第二部分背景及目的：
　　 隨著各種血流再灌注心肌的治療方案的廣泛應(yīng)用，心肌梗塞進入再灌注時代，而隨之產(chǎn)生的再灌注損傷的防

6、治也成為研究熱點。在長時間缺血后，血流再灌注前多次反復(fù)短時的缺血再灌注處理可有效降低缺血再灌注損傷，這一現(xiàn)象稱為缺血后處理（IPOC）。由于缺血發(fā)生的時間的不確定性，缺血后處理與缺血預(yù)適應(yīng)（IPC）相比有著更為廣闊的臨床應(yīng)用前景。然而，研究表明，心肌缺血后梗死的嚴重程度與缺血的時間成正相關(guān)，而IPOC的保護效應(yīng)在不同的缺血時間內(nèi)表現(xiàn)不同。當缺血時間過短或者過長，IPOC的保護效果都不明顯。因此我們研究目的旨在揭示不同缺血時間條件下，從血

7、流灌注量及心肌細胞線粒體功能方面研究血管和心肌細胞損傷情況及IPOC的保護機制，從而確定IPOC對缺血心臟保護作用的時間窗并闡明影響確定保護作用時間窗的相關(guān)機制。
　　 實驗方法：
　　 野生型C57BL/6小鼠隨機分為九組。（1）假手術(shù)組；（2）15分鐘缺血再灌注組；（3）15分鐘缺血后處理組；（4）30分鐘缺血再灌注組；
　　 （5）30分鐘缺血后處理組；（6）45分鐘缺血再灌注組；（7）45分鐘缺血后處理組

8、；（8）60分鐘缺血再灌注組；（9）60分鐘缺血后處理組。假手術(shù)組開胸，不做干預(yù)。缺血再灌注模型組給予冠狀動脈左前降支結(jié)扎相應(yīng)時間造成缺血，再開放灌注60分鐘。缺血后處理模型組給予冠狀動脈左前降支結(jié)扎相應(yīng)時間造成缺血，隨后反復(fù)結(jié)扎開放左前降支10秒缺血/10秒再灌注循環(huán)，一共3次，之后再開放灌注60分鐘。體內(nèi)組織氧分壓采用電子順磁共振法（EPR）測量。局部血流量采用激光多普勒血流探測技術(shù)測定。再灌60分鐘后取缺血危險區(qū)心肌組織標本用于測

9、定線粒體復(fù)合體酶（還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（NADH-DH），琥珀酸-細胞色素C 還原酶（SCR）以及細胞色素C 氧化酶（CcO））活性及eNOS蛋白表達。再灌后24小時后取心臟行TTC 染色用于梗死面積測定。
　　 結(jié)論：
　　 小鼠心肌缺血后處理對缺血再灌注損傷心臟的保護作用具有時間窗效應(yīng)。其對缺血心肌可保護的缺血時間窗是30分鐘至45分鐘缺血時間。而提高局部血流量和提高心肌細胞線粒體呼吸鏈耗氧產(chǎn)能功能是決定

10、可保護缺血時間窗的重要機制。缺血再灌注損傷，缺血后處理，電子順磁共振，局部血流量，線粒體第三部分背景及目的：
　　 急性心肌梗死經(jīng)過各種再灌恢復(fù)血供的治療抑制了梗死進一步擴大，同時也造成了新的損傷-再灌注損傷，而在其后心肌修復(fù)中心肌重構(gòu)對心功能有重要的影響。一方面梗死區(qū)發(fā)生修復(fù)性纖維化，維持心臟結(jié)構(gòu)，防止室壁破裂，另一方面非梗死區(qū)纖維化則使心臟順應(yīng)性降低，影響了心肌收縮和舒張功能。而如何調(diào)節(jié)心肌纖維化進程，使梗死后心肌更好恢復(fù)功

11、能的則成為研究重點。
　　 心肌組織經(jīng)過缺血再灌注，部分心肌細胞壞死形成梗死區(qū)，經(jīng)過炎癥過程從而發(fā)生纖維化以修復(fù)替代壞死的心肌組織形成疤痕組織。成肌纖維細胞是一種由心肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化而來，具有收縮活性的細胞，對心肌損傷的修復(fù)起重要作用。TGF-β1信號通路被證明可誘導(dǎo)成肌纖維細胞的轉(zhuǎn)化形成，而體外細胞實驗證明在高氧條件下可激活TGF-β1信號通路可增加心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化。
　　 我們前期實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過急性缺

12、血再灌注60分鐘后，小鼠心肌組織氧分壓明顯高于缺血前出現(xiàn)組織高氧狀態(tài)。而在eNOS基因敲除小鼠或是eNOS 活性抑制劑干預(yù)小鼠經(jīng)過缺血再灌注后組織的氧分壓明顯低于野生型小鼠，提示eNOS 產(chǎn)生的NO是參與調(diào)節(jié)缺血再灌注產(chǎn)生高氧狀態(tài)的重要因素。本次實驗中，我們將長期監(jiān)測缺血再灌注后組織氧分壓變化情況，闡明心肌缺血區(qū)內(nèi)成肌纖維細胞的轉(zhuǎn)化機制與再灌后的組織高氧之間關(guān)系，以期揭示心肌重構(gòu)調(diào)控機制，對心肌纖維化區(qū)域靶向調(diào)節(jié)提供依據(jù)。
　　

13、 實驗方法：
　　 分別建立心肌缺血再灌注和心肌組織高氧兩種小鼠模型。
　　 一、建立小鼠心肌缺血再灌注模型。結(jié)扎冠狀動脈左前降支30分鐘，而后開放灌注3天或14天；假手術(shù)組以相同方式開胸，但不做結(jié)扎。分為六個組，每組7只：（1）C57 野生型小鼠假手術(shù)組（C57 sham）；（2）C57 野生型小鼠缺血再灌注組（C57 I/R）；（3）eNOS基因敲除小鼠假手術(shù)組（eNOS-/-sham）；（4）eNOS基因敲除小鼠缺

14、血再灌注組（eNOS-/-I/R）；
　　 （5）iNOS基因敲除小鼠假手術(shù)組（iNOS-/-sham）；（6）iNOS基因敲除小鼠缺血再灌注組（iNOS-/-I/R）。血流再灌注60分鐘，1天，3天，5天，7天，14天利用電子順磁共振（EPR）波譜儀連續(xù)監(jiān)測心肌組織氧分壓，缺血再灌注前后利用激光多普勒血流監(jiān)測儀監(jiān)測血流再灌注情況。灌注14天后取心肌組織切片免疫組織化學(xué)染色。灌注3天時取心肌缺血區(qū)組織用ELISA和免疫印跡法檢測

15、TGF-β1，Smad，p21和α-SMA信號。
　　 二、建立組織高氧模型。C57 野生型小鼠置于95％氧氣+5％二氧化碳（95％O2+5％CO2）環(huán)境中處理3天，對照組處于正?？諝猸h(huán)境中。分為四組：（1）對照組（C57 sham）：正?？諝猸h(huán)境；（2）高氧處理組（Hyperoxygen treat）：95％ O2+5％CO2環(huán)境；（3）NO 供體SNAP 干預(yù)組（SNAP treat）：95％ O2+5％CO2環(huán)境并給以SN

16、AP 干預(yù)；（4）SOD 模擬物EUK134 干預(yù)組（EUK134 treat）：95％ O2+5％CO2環(huán)境并給以EUK134 干預(yù)。
　　 結(jié)論：
　　 小鼠缺血再灌注引起的心肌組織高氧狀態(tài)可誘導(dǎo)TGF-β1-Smad信號通路增加，并上調(diào)p21而增加α-SMA表達，促進梗死區(qū)成肌纖維細胞轉(zhuǎn)化形成；而NO對高氧誘導(dǎo)的TGF-β1激活通路產(chǎn)生反饋性抑制調(diào)節(jié)作用。這一機制的闡明對心肌梗死修復(fù)的干預(yù)治療提供了新的觀點和視野。