甘草甜素在脊髓缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 脊柱骨折脫位或脊髓慢性壓迫均可造成脊髓的缺血再灌注損傷。脊髓缺血再灌注損傷(SCII)是指脊髓損傷等導(dǎo)致脊髓缺血的因素去除后，脊髓恢復(fù)血供，神經(jīng)功能不僅得不到改善，反而在原缺血損傷基礎(chǔ)上進(jìn)一步加重，甚至出現(xiàn)不可逆性脊髓神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的現(xiàn)象。缺血再灌注損傷在脊髓損傷后的繼發(fā)損傷(SecondarySCI)中扮演了重要角色。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)廣泛的存在于脊髓缺血再灌注后引起的神經(jīng)損傷的病理過程中。而這一過程給

2、當(dāng)前治療脊髓缺血再灌注損傷提供了一個潛在的介入點。HMGB1是一組與染色質(zhì)相關(guān)的蛋白，由于在凝膠電泳時具有高移動性，所以被命名為高遷移性蛋白組(highmobilitygroup)，其中的HMGB1在細(xì)胞發(fā)生壞死時擴(kuò)散到細(xì)胞外液中。一旦被分泌或擴(kuò)散到細(xì)胞外夜中，HMGB1能夠開啟包含HMGB1/TLR-4/NF-κB的危險信號分子通路，加劇炎癥反應(yīng)。甘草甜素(Glycyrrhizin)為中藥甘草有效成分的第3代提取物，主要成分為α體甘草

3、甜素鹽成分，具有較強的非特異性抗炎作用和類激素作用。本實驗運用小鼠脊髓缺血再灌注模型，觀察小鼠缺血再灌注模型后脊髓組織中HMGB1、RAGE、TLR-4和NF-κB的活性形式磷酸化的P65(PP65)的變化以及甘草甜素對其干預(yù)的影響，探討甘草甜素在脊髓缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用機(jī)制，為其在臨床治療脊髓缺血再灌注損傷提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 選取第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室飼養(yǎng)的雄性C57BL/6小鼠作為實驗動物。通

4、過顯微鏡下開胸手術(shù)，顯微血管夾夾閉法阻斷小鼠的主動脈弓(位于左頸總動脈與左鎖骨下動脈之間)、左鎖骨下動脈(起始部，位于胸廓內(nèi)動脈分支之前段)來造成C57BL/6小鼠的脊髓缺血，缺血時間分別為10min及15min組，通過預(yù)實驗檢驗發(fā)現(xiàn)15min組建模成功率更高，后所有實驗組均采取15min缺血時間。實驗動物分為三組(每組n=6)：實驗組、假手術(shù)組、對照組(阻斷缺血后給予等量PBS)和甘草甜素組(10mg/kg，阻斷缺血后給藥)。術(shù)后實驗

5、動物均同條件飼養(yǎng)，選取術(shù)后3小時、6小時、12小時、24小時、3天、7天共六個時間節(jié)點，通過心臟甲醛灌注法處死，完整取下小鼠全段脊髓組織，液氮冷凍保存材料。術(shù)后運動功能評價通過后肢運動功能評分法來定性研究。小鼠脊髓組織病理學(xué)觀察通過使用H&E染色發(fā)進(jìn)行比較對照研究。通過RT-PCR或ELISA檢測法對不同時間節(jié)點再灌注損傷后脊髓組織內(nèi)炎性細(xì)胞因子在mRNA水平或蛋白水平及其受體表達(dá)的變化進(jìn)行了測定。通過Western-blot方法檢測測

6、定NF-κB的活性亞體pp65的活性，從而定量分析其活化情況。本實驗所有的量化數(shù)據(jù)均表示為平均值±SD。統(tǒng)計數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析法。對于神經(jīng)功能缺損評分等定性數(shù)據(jù)，采用Mann-WhitneyU檢驗法進(jìn)行兩組之間的比較。定義P<0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 甘草甜素組與對照組相比，顯著改善神經(jīng)系統(tǒng)的功能，減少脊髓前角運動神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，降低NF-κB的激活和隨后的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)(TNF和IL

7、-1β)，減輕缺血后脊髓組織內(nèi)的中性粒細(xì)胞的浸潤。針對HMGB1的特異性阻斷治療也減少了其自身的表達(dá)。HMGB1作為公認(rèn)的一個關(guān)鍵因素介導(dǎo)著體外和體內(nèi)神經(jīng)元損傷的細(xì)胞反應(yīng)。在我們的模型中，HMGB1在非常早期的階段即顯著增加，在缺血再灌注損傷一天后達(dá)到高峰。直到第7天它們?nèi)员３衷诟咚?，雖然略有逐漸減少的趨勢。我們還發(fā)現(xiàn)，HMGB1受體RAGE和TLR4的表達(dá)水平在此過程中同時明顯升高。放大后的HMGB1的信號通路反饋機(jī)制及其介導(dǎo)的炎癥

8、反應(yīng)導(dǎo)致了脊髓損傷的進(jìn)一步加劇。然而，這也表明，在早期針對性的抑制HMGB1可能提供極大的好處，并作為治療缺血再灌注損傷有吸引力的策略。在日本，甘草甜素作為一種傳統(tǒng)中藥制劑多年來已被用于對乙型和丙型肝炎的治療。后來，甘草甜素發(fā)現(xiàn)可以與HMGB1結(jié)合，抑制其細(xì)胞因子作用，提示在炎癥反應(yīng)相關(guān)疾病中的廣泛應(yīng)用前景。同時我們發(fā)現(xiàn)，甘草甜素能抑制NF-κB活化及炎性細(xì)胞因子的后續(xù)產(chǎn)生。缺血再灌注后HMGB1的主要來源仍然不明朗。在早期缺血后，可能

9、主要來源于薄壁細(xì)胞和非實質(zhì)細(xì)胞受損或壞死的釋放，以及從細(xì)胞核內(nèi)主被動分泌而來。這些HMGB1刺激受傷組織中的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或中性粒細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，包括腫瘤壞死因子、IL-1、IL-8等。，反過來這些細(xì)胞因子通過誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞自分泌或旁分泌方式的方式來刺激HMGB1的分泌。因此，在缺血再灌注脊髓損傷的晚期，局部存在或聚集的巨噬細(xì)胞主動分泌HMGB1的可能可能是Hmgb1維持高水平的主要原因，并導(dǎo)致了炎癥相關(guān)疾病的持久存在

10、。甘草甜素不僅在早期階段阻斷HMGB1的活性，同時也減少其在后期的表達(dá)水平。NF-κB是一個關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)許多炎癥相關(guān)的基因，并肯定與脊髓缺血再灌注損傷呈正相關(guān)。在本研究中，我們也觀察到NF-κB的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的增加以及激活和缺血再灌注后的核易位。HMGB1的啟動、激活和易位可能代表下游危險信號通路的打開及反饋性放大。甘草甜素治療通過抑制NF-κB活化，減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
　　 結(jié)論：
　　 甘草甜素對小