甘草甜素對大鼠心肌缺血再灌注后的保護作用及其機制研究.pdf

1、第一部分:甘草甜素通過抑制HMGB1對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用
　　 背景:心肌缺血再灌注損傷指缺血心肌在恢復血流再灌注后，反而加重其結構破壞，引起細胞死亡，導致梗死范圍擴大，造成心功能的進一步損害并影響心肌梗死患者的預后。心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機制較復雜，氧自由基、鈣超載、炎癥介質(zhì)是比較公認的機制，其中炎癥反應是造成心肌缺血再灌注損傷損傷的重要原因之一。如何揭示其發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)及合理的干預以減少缺血再灌注后炎癥反應是

2、目前研究的熱點，也是本課題研究的出發(fā)點。
　　 高遷移率族蛋白B1(high mobility group box protein1，HMGB1)是一種重要的“晚期”炎性細胞因子，HMGB1還可能是致炎細胞因子調(diào)控網(wǎng)絡中的一個中心環(huán)節(jié)，炎癥反應的晚期，HMGB1釋放增加，釋放入血的HMGB1通過內(nèi)分泌和旁分泌的形式導致炎癥級聯(lián)反應的進一步擴大。HMGB1作為一種重要的“晚期”炎性細胞因子不僅能促使TNF-α、IL-1等表達，還能

3、激活ERK激酶、P38MAP K激酶、JNK激酶并促使核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB發(fā)生核移位。這些研究提示，HMGB1可能是致炎細胞因子調(diào)控網(wǎng)絡中的一個中心環(huán)節(jié)，不僅自身分泌有級聯(lián)放大的生物學效應，還能調(diào)節(jié)其他炎癥因子的分泌，是直接導致缺血再灌注損傷的“晚期”重要介質(zhì)。而尋找一種藥物抑制HMGB1，減輕炎癥反應，成為了減輕心肌缺血再灌注損傷的重要靶點。
　　 甘草甜素(Glcyrrhizin，GL)是一種提取甘草根部的活性組分，具有抗炎

4、癥、免疫調(diào)節(jié)作用、抗過敏等作用。大量的文獻證實甘草甜素可以通過抑制炎癥反應，減輕腦、脊髓、腸道、肝臟等器官的缺血再灌注損傷，而其在心肌缺血再灌注損傷中是否同樣具有保護作用，目前國內(nèi)外均尚未見研究，這也是本研究的主要出發(fā)點之一。
　　 總上所述，我們設計了甘草甜素干預心肌缺血再灌注損傷的實驗，證實其是否具有心肌保護作用，以及與HMGB1的關系，進一步闡述甘草甜素在缺血再灌注損傷中的保護機制。
　　 實驗目的:
　　

5、 1.建立大鼠心肌缺血再灌注模型。
　　 2.觀察實驗各組缺血再灌注大鼠血流動力學情況變化。
　　 3.觀察實驗各組缺血再灌注大鼠心肌缺血壞死情況及其病理改變。
　　 4.觀察實驗各組炎癥因子的表達以及HMGB1的表達情況。
　　 實驗方法:
　　 實驗大鼠分為:假手術(Sham)組:共10只，術前7天，每天大鼠尾靜脈注射生理鹽水1ml，模型建立時只穿線，不結扎;缺血再灌注組(NS):術前7天，每

6、天大鼠尾靜脈注射生理鹽水1ml。結扎冠狀血流30分鐘，放松結扎線后再灌注1小時，造成I/R損傷模型;甘草甜素干預(GL)組:術前7天，每天大鼠尾靜脈注射甘草甜素預處理(10 mg/kg)，甘草甜素+重組HMGB1組(GL+rHMGB1):術前7天，每天大鼠尾靜脈注射甘草甜素預處理(10 mg/kg)。結扎冠脈血流30分鐘后大鼠尾靜脈立即給予重組HMGB1（100μg/鼠）。
　　 實驗結扎冠狀血流30分鐘，放松結扎線后再灌注1小

7、時，造成心肌缺血再灌注損傷模型，進行有關指標的檢測。檢測各組造模后從0分鐘到24小時血清HMGB1水平，炎性細胞因子水平以及血流動力學指標，并檢測其相關梗死面積及病理變化。
　　 實驗結果:
　　 1:實驗各組之間血流動力學指標:心率、平均動脈壓、收縮壓乘積等無明顯差異(P＞0.05)。
　　 2:NS組心肌梗死面積最大(P＜0.05)，GL可以減少心肌梗死面積(P＜0.05)，GL+rHMGB1組心肌梗死面積較

8、GL組明顯(P＜0.05)，但仍低于NS組(P＜0.05);而且各組之間心肌缺血面積無明顯統(tǒng)計學差異。
　　 3:Sham組大鼠心肌纖維完整，細胞核、細胞漿完整;NS組大鼠心肌細胞排列紊亂，細胞有破裂及溶解現(xiàn)象，可見壞死細胞，炎細胞浸潤。GL組心肌細胞部分間質(zhì)有水腫，少量炎細胞浸潤， GL+HMGB1組心肌細胞排列紊亂，染色不均，可見細胞水腫，點狀壞死，較NS組減少(P＜0.05)。
　　 4:NS組心肌肌鈣蛋白，LDH

9、，AST等水平最高(P＜0.05)，GL組較NS組下降(P＜0.05)，GL+rHMGB1組心肌梗死面積較GL組增加(P＜0.05)，但仍低于NS組(P＜0.05);
　　 5:NS組HMGB1水平和炎性細胞因子TNF-α，IL-6水平最高(P＜0.05)，GL-組血清HMGB1水平和炎性細胞因子TNF-α，IL-6等水平顯著降低(P＜0.05)。
　　 實驗結論及意義:
　　 1: HMGB1可以增加心肌缺血再

10、灌注損傷中炎性細胞因子TNF-α，IL-6等表達，增加心肌梗死面積。
　　 2:GL可能通過抑制心肌缺血再灌注后HMGB1的表達，減輕炎癥反應，減少心肌缺血再灌注損傷。
　　 第二部分:甘草甜素對大鼠缺血再灌注心肌細胞凋亡的影響及其機制研究
　　 背景: 甘草甜素是一種提取甘草根部的活性組分，具有抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)作用、抗過敏等作用。國外學者已有報告其對缺血再灌注誘導損傷實驗動物器官如脊椎，肝臟和大腦等有保護作用，

11、同時在我們前面的課題中已證實甘草甜素在心肌缺血再灌注損傷中同樣具有保護作用。但甘草甜素干預對缺血再灌注心肌細胞凋亡的影響尚未有報道，這是本課題的出發(fā)點之一。
　　 近年來人們對凋亡在心肌缺血再灌注損傷中的認識逐漸加深，細胞凋亡是細胞程序性死亡，心肌缺血再灌注損傷時心肌凋亡是其中重要機制之一，減少心肌細胞凋亡，可以明顯改善心功能。Bax和Bcl-2基因是調(diào)控凋亡的主要基因，其蛋白水平高低與凋亡調(diào)控直接相關:Bax增加，促進細胞凋亡

12、，Bcl-2增加，抑制細胞凋亡。細胞色素C(Cyt C)從線粒體釋放后可以誘導Bax基因從線粒體釋放到細胞質(zhì)，引起細胞凋亡，而Bcl-2可以阻止細胞色素C的釋放，抑制細胞凋亡。Caspases酶是細胞凋亡的關鍵酶，其中Caspases-3是Caspases級聯(lián)瀑布下游最關鍵的凋亡蛋白酶，Bax蛋白可以使細胞色素C通過線粒體膜，激活Caspases-9，進一步激活Caspases-3，導致細胞凋亡。由上可見Bax、Cyt C以及Caspa

13、se-3等蛋白在細胞凋亡中發(fā)揮了重要的作用，所以在我們的課題中，對甘草甜素干預對Bax、Cyt C等的影響也進行了相關的研究。
　　 最近絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑在心肌細胞凋亡中的作用日益受到關注。MAPK有4個主要的亞家族:細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)，c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)。本課題的出發(fā)點在于證實甘草甜素對缺血再灌注心肌細

14、胞凋亡的影響，其分子機制是否與蛋白激酶(MAPK)途徑，特別是JNK通路有關。針對這一問題進行了本研究，進一步探討其保護心肌缺血再灌注損傷的機制。
　　 實驗目的:
　　 1.明確甘草甜素干預后各組心肌細胞凋亡的情況。
　　 2.明確甘草甜素干預對心肌Bax、Cyt C表達以及Caspase3活性等的影響。
　　 3.研究甘草甜素對磷酸激酶相關信號通路的影響，特別是JNK通路的關系，進一步闡述其對缺血再灌

15、注心肌凋亡的影響，及其心肌保護作用的機制。
　　 實驗方法:
　　 實驗大鼠分為:假手術(Sham)組:共10只，術前7天，每天大鼠尾靜脈注射生理鹽水1ml，模型建立時只穿線，不結扎;缺血再灌注組(NS):術前7天，每天大鼠尾靜脈注射生理鹽水1ml。結扎冠狀血流30分鐘，放松結扎線后再灌注1小時，造成I/R損傷模型;甘草甜素干預(GL)組:術前7天，每天大鼠尾靜脈注射甘草甜素預處理(10 mg/kg)，甘草甜素+重組HM

16、GB1組(GL+rHMGB1)組:術前7天，每天大鼠尾靜脈注射甘草甜素預處理(10 mg/kg)。結扎冠脈血流30分鐘后大鼠尾靜脈立即給予重組HMGB1(∈)100μg/鼠）。
　　 實驗結扎冠狀血流30分鐘，放松結扎線后再灌注1小時，造成心肌缺血再灌注損傷模型，進行有關指標的檢測。Tunnel染色檢測心肌細胞凋亡情況，免疫印跡法檢測心肌凋亡Bax、Cyt C基因，心肌細胞caspase-3活性。此外，還對缺血再灌注誘導的蛋白激

17、酶家族包括ERK1/2、JNK以及p38磷酸化進行了分析。
　　 實驗結果:
　　 1.Tunnel染色結果提示NS組心肌細胞凋亡最明顯(P＜0.05)，GL組心肌細胞凋亡程度較之下降(P＜0.05)，GL+rHMGB1組心肌凋亡較GL組較明顯，但仍低于NS組(P＜0.05);
　　 2:免疫印跡法顯示GL可以改變Bax基因和Cyt C的細胞內(nèi)分布，抑制凋亡過程中Bax基因從細胞質(zhì)向線粒體轉(zhuǎn)移，并使細胞色素C從線

18、粒體到細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移減少，而甘草甜素+重組HMGB1組的抑制作用減弱(P＜0.05);總體細胞水平未見Bax及細胞色素C的變化(P＞0.05)。
　　 3:GL可以抑制JNK細胞通路磷酸化(P＜0.05)，而對ERK1/2或P38磷酸化無影響(P＞0.05)，而GL+rHMGB1組的抑制作用減弱，但JNK磷酸化水平仍低于NS組(P＜0.05)。
　　 實驗結論及意義:
　　 1:甘草甜素可以改變Bax基因和Cyt C

19、的分布，減輕再灌注后心肌凋亡，對心肌有保護作用。
　　 2:甘草甜素減輕心肌細胞凋亡，對缺血再灌注大鼠的心肌保護機制可能與抑制JNK磷酸化有關
　　 第三部分:JNK/Bax細胞通路在大鼠心肌缺血再灌注中的意義
　　 背景:
　　 缺血再灌注損傷是指組織器官如心、腦、腎等在一定時間的缺血后，在重新恢復血供后，不僅不能恢復改善組織器官的功能，反而起到加重功能代謝障礙以及組織損害，其中實驗表明絲裂原活化蛋白激

20、酶(MAPK)途徑介導的細胞凋亡參與了缺血再灌注的發(fā)生。其中JNK細胞通路在心肌缺血后細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導途徑中起重要作用，其作為細胞因子信號傳導的重要途徑，廣泛參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)、炎癥、腫瘤等多種生理、病理生理過程，在缺血再灌注、心臟驟停、炎癥反應等中起到了重要作用。
　　 細胞凋亡是一種主動地、程序性和生理性的細胞死亡，指在一定條件下，核細胞通過啟動內(nèi)部機制，通過內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細胞自然死亡

21、過程，表現(xiàn)為一系列的細胞核變化。c-Jur氨基末端激酶(JNK)是促分裂原活化蛋白激酶家族(MAPK)成員之一，位于細胞胞質(zhì)之中，可被炎癥介質(zhì)、細胞因子、休克創(chuàng)傷、缺血再灌注等多種因素激活，大量實驗表明JNK細胞通路參與了細胞凋亡的病理生理過程。
　　 研究表明缺血再灌注后數(shù)分鐘就可以發(fā)現(xiàn)線粒體及細胞質(zhì)JNK被激活，可見其在心肌缺血再灌注損傷中起著重要作用;有學者研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血區(qū)JNK活性明顯增加，采用JNK抑制劑SP6001

22、25可以阻斷Bax凋亡途徑;同樣在大鼠腦缺血再灌注模型中，采用JNK抑制劑AS601245可以明顯降低缺血再灌注引起的神經(jīng)細胞的凋亡，有學者在肝缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn)再灌注后JNK活性明顯升高，采用JNK抑制劑可以明顯緩解肝細胞的凋亡。
　　 本課題采用了JNK抑制劑SP600125以及重組HMGB1進行了干預，證實JNK通路以及HMGB1在缺血再灌注損傷中的作用，從而為甘草甜素通過抑制HMGB1以及抑制JNK磷酸化，對缺血再灌注

23、心肌起到保護作用的機制提供一定的論據(jù)。針對這些問題，我們設計了本實驗，明確JNK通路及HMGB1在心肌缺血再灌注中細胞凋亡的意義，進一步闡述心肌缺血再灌注損傷的機制。
　　 實驗目的:
　　 1.建立大鼠心肌缺血再灌注模型，觀察實驗各組缺血再灌注大鼠心肌凋亡情況，觀察心肌Bax，CytochromeC，Caspase3的表達情況。
　　 2.并用JNK抑制劑SP600125以及重組HMGB1進行干預，明確JNK通

24、路以及HMGB1在心肌缺血再灌注中細胞凋亡的意義，進一步證實甘草甜素的心肌缺血再灌注損傷的機制。
　　 實驗方法:
　　 實驗大鼠分為:缺血再灌注組(NS組):共10只，冠脈結扎前30分鐘大鼠尾靜脈注射生理鹽水1ml，結扎冠狀血流30分鐘，放松結扎線后再灌注1小時，造成I/R損傷模型;SP600125干預組(NS+SP600125組):冠脈結扎前30分鐘，大鼠尾靜脈注射SP600125溶液1ml(0.5 mg/kg)，結

25、扎冠狀血流30分鐘，放松結扎線后再灌注1小時，造成I/R損傷模型，24小時后進行有關指標的檢測。SP600125+重組HMGB1干預組(SP600125+rHMGB1組):冠脈結扎前30分鐘，經(jīng)大鼠尾靜脈注射SP600125溶液1ml預處理(0.5 mg/kg)，結扎前大鼠尾靜脈立即給予重組HMGB1（100μg/鼠），結扎冠狀血流30分鐘，放松結扎線后再灌注1小時，造成I/R損傷模型，24小時后進行有關指標的檢測，Tunnel染色檢測

26、心肌細胞凋亡情況，免疫印跡法檢測心肌凋亡Bax、Cyt C蛋白，心肌細胞caspase-3以及JNK活性。
　　 實驗結果
　　 1:免疫印跡法顯示NS組JNK活性最強(P＜0.05)，NS+SP600125組JNK活性最弱(P＜0.05)。
　　 2:Tunnel染色結果提示NS組心肌細胞凋亡最明顯(P＜0.05)，NS+SP600125組心肌細胞凋亡程度較之下降(P＜0.05)，SP600125+rHMGB1

27、組心肌凋亡較NS+ SP600125組較明顯，但仍低于NS組(P＜0.05);
　　 3:免疫印跡法顯示SP600125可以改變Bax基因和Cyt C的細胞內(nèi)分布，抑制凋亡過程中Bax基因從細胞質(zhì)向線粒體轉(zhuǎn)移，并使細胞色素C從線粒體到細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移減少，而SP600125+rHMGB1組的抑制作用減弱(P＜0.05);總體細胞水平未見Bax及細胞色素C的變化(P＞0.05)。
　　 實驗結論及意義:
　　 1:HMG