P2X7受體在脊髓缺血再灌注損傷中的作用研究.pdf

1、脊髓缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷是引起胸主動脈及脊柱手術(shù)后發(fā)生截癱的最主要原因。由于治療困難，致殘率與致死率非常高。目前關(guān)于脊髓I/R損傷病理學(xué)的確切機(jī)制仍不清楚，有研究表明同一系列復(fù)雜的病理過程有關(guān)，包括：興奮性中毒，氧自由基的生成，炎癥和凋亡。因此，脊髓I/R損傷已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的難題和熱點(diǎn)。盡管目前使用很多策略來增加脊髓對缺血的耐受性，減少其神經(jīng)并發(fā)癥，但是臨床尚無治療截癱病人的

2、特效藥物，迫切需要找到一種有效的藥物治療方式。三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，ATP)作為第一信使參與信息傳遞，調(diào)節(jié)組織細(xì)胞的生化代謝與生理活動。更重要的是，組織損傷時(shí)有大量ATP釋放，參與免疫和炎癥反應(yīng)。傳導(dǎo)ATP信號的受體分為P2X和P2Y受體兩類，其中P2X受體是配體門控的離子通道。P2X7受體是P2X受體第七個(gè)亞型，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)倍受關(guān)注。高濃度ATP反復(fù)持續(xù)的激活可以使P2X7受體形成一個(gè)大的質(zhì)

3、膜孔道，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。有研究表明，拮抗P2X7受體可以減輕大腦中動脈閉塞引起的腦缺血再灌注損傷。P2X7受體在大鼠脊髓I/R損傷中的作用目前尚未見相關(guān)報(bào)道。
　　 目的：
　　 1、建立穩(wěn)定的大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型
　　 2、研究P2X7受體脊髓缺血再灌注損傷后在脊髓灰質(zhì)的表達(dá)變化。
　　 3、研究拮抗P2X7受體后，是否可以減輕脊髓缺血再灌注損傷，并探討相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：
　　

4、 1、運(yùn)用2F-Fogarty導(dǎo)管阻斷大鼠降主動脈下段，結(jié)合全身低血壓，來建立穩(wěn)定的大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組，其他同手術(shù)組，但不誘導(dǎo)脊髓缺血。
　　 2、脊髓缺血再灌注損傷后1d、3d、5d、7d，應(yīng)用BBB評分評價(jià)大鼠運(yùn)功功能的改變；取脊髓L4-L6行Nissl染色評價(jià)脊髓前角正常運(yùn)動神經(jīng)元的數(shù)量；運(yùn)用雙重標(biāo)記的免疫熒光組織化學(xué)鑒定P2X7受體的表達(dá)；運(yùn)用Western-blot檢測術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)P2X7受體在蛋白

5、水平上的變化。
　　 3、在大鼠缺血再灌注15min后，股靜脈給予P2X7受體拮抗劑BBG(50mg/kg)，術(shù)后第2d和3d連續(xù)給藥，共給藥3次；Saline組給予和BBG50組相同的劑量的生理鹽水。觀察術(shù)后4d、14d、21d，大鼠的運(yùn)動功能的改善情況，然后行Nissl染色，雙重標(biāo)記的免疫熒光組織化學(xué)，檢測mRNA和蛋白水平上P2X7受體的變化。并初步探討P2X7的激活是否和炎癥信號途徑MAPK有關(guān)。
　　 結(jié)果：<

6、br>　　 1、建立了大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型，實(shí)驗(yàn)中得出的模型成功復(fù)制的要點(diǎn)：雌性SD大鼠260-300g，肛溫維持在35.9左右，術(shù)中大鼠的全身循環(huán)血壓維持在46mmHg左右，股動脈血壓維持在7mmHg左右，缺血9min。
　　 2、脊髓缺血再灌注損傷后1d，3d，5d，7d后大鼠的運(yùn)動功能明顯障礙，同sham組比較，BBB評分有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，但是實(shí)驗(yàn)組間大鼠運(yùn)動功能評分無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.

7、05)。隨著再灌注損傷時(shí)間的延長，大鼠的脊髓前角的正常運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，和sham組比，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，組間比較也有的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。雙重標(biāo)記的免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果顯示：脊髓缺血再灌注損傷后，P2X7受體只在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)，在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞上未見明顯表達(dá)?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞存在于脊髓前角和背角的損傷部位。隨著再灌注時(shí)間的延長，脊髓損傷程度加重，小膠質(zhì)細(xì)胞的活化越多。同sham組比較，術(shù)后

8、第3d，小膠質(zhì)細(xì)胞開始出現(xiàn)大量明顯的激活。脊髓缺血再灌注后，星形膠質(zhì)細(xì)胞大量激活，1d有少量細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，但是不明顯，到5d和7d時(shí)活化較為明顯，并且星形膠質(zhì)細(xì)胞只在損傷周圍活化，損傷部位無星形膠質(zhì)細(xì)胞。Western-blot結(jié)果顯示：從再灌注損傷1d開始到7d，P2X7受體的蛋白水平逐漸增加，7d表達(dá)最多，同sham組和其他實(shí)驗(yàn)組相比(P＜0.05)。
　　 3、給予拮抗劑BBG后，大鼠在術(shù)后4d，14，21d的運(yùn)動功

9、能明顯改善，BBB評分同Saline組比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，其中第BBG50組第14d運(yùn)動功能改善最為明顯，同BBG504d比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。Nissl染色提示：給予拮抗劑BBG后脊髓前角正常運(yùn)動神經(jīng)元的數(shù)量明顯增多，同Saline組比較，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，其中14d的神經(jīng)元變化最明顯，同4d比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。RT-PCR結(jié)果顯示：同sham組相比，Sali

10、ne組P2X7受體的mRNA顯著增多，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，其中14d表達(dá)最多，同Saline組4d比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Saline組相比：BBG組大鼠P2X7受體的mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，其中14d的下調(diào)較明顯，同BBG組4d比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Western-blot結(jié)果顯示：給予拮抗劑BBG后，同Saline組比較，實(shí)驗(yàn)組P2X7受體的表達(dá)下調(diào)(P＜0.01)

11、，其中以14d最為明顯，同其他4d比較，(P＜0.01)；同Saline組比較：BBG組p-ERK1/2受體表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01)，其中以14d最為明顯，同4d比較(P＜0.01)。雙重標(biāo)記的免疫熒光組織化學(xué)顯示：BBG組大鼠，14d小膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓前角和背角的活化程度明顯減弱，活化范圍明顯減少，Iba1的熒光IOD與Saline組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。BBG50組大鼠，14d星形質(zhì)細(xì)胞在脊髓前角的熒光強(qiáng)度明顯減弱，

12、IOD與Saline組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。Western-blot結(jié)果顯示：給予拮抗劑BBG后，同Saline組比較，實(shí)驗(yàn)組P2X7受體的表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，其中以14d最為明顯，同其他實(shí)驗(yàn)組比較，(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)組p-ERK1/2受體表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01)，其中以14d最為明顯，同其他實(shí)驗(yàn)組比較，(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、脊髓缺血再灌注引起的繼發(fā)性損傷和P2X7受體的