抗糖尿病藥物中激活Nrf2通路的抗氧化劑對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制研究.pdf

1、流行病學(xué)調(diào)查顯示，糖尿病患者中某些腫瘤發(fā)生率增高，2010年美國糖尿病協(xié)會和美國癌癥協(xié)會的共識報(bào)告顯示2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)患者罹患結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌等的風(fēng)險增加;且其相關(guān)性在近期發(fā)表于British Medical Journal的meta分析中得到了證實(shí)。隨著糖尿病患病率的增加，糖尿病合并腫瘤患者群也日益增多。對于糖尿病合并腫瘤這一特殊人群也需采取相應(yīng)

2、的降糖措施，但降糖治療對腫瘤生物學(xué)行為影響的具體機(jī)制尚不明確。
　　二肽基肽酶Ⅳ抑制劑(DPP-4i)是臨床常用的降糖藥物，且被美國臨床內(nèi)分泌學(xué)會(AACE)糖尿病綜合管理指南推薦DPP-4i作為二甲雙胍之外的一線藥物選擇。我們前期的meta分析提示，DPP-4i并不增加新生腫瘤發(fā)生風(fēng)險，故其對單純的糖尿病患者是適用的;其在糖尿病合并腫瘤患者中的應(yīng)用是否安全及其具體的影響機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　α-硫辛酸(alpha

3、lipoic acid, ALA)由于其能夠增加內(nèi)源性抗氧化劑及Ⅱ相解毒酶的水平，具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的作用。因此ALA常被作為抗氧化劑用于預(yù)防糖尿病、高血壓等疾病對機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷;同時也被推薦作為抗腫瘤藥物。ALA的抗腫瘤作用主要表現(xiàn)為抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡;而對于腫瘤轉(zhuǎn)移的影響目前尚未得到研究者們的太多關(guān)注。
　　目的：
　　本研究擬通過離體腫瘤模型觀察DPP-4i、ALA對腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲行為的影響

4、;通過建立肝癌、結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移模型裸小鼠，觀察DPP-4i、ALA對體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。并利用離體及在體腫瘤模型，結(jié)合基因沉默或過表達(dá)/藥理激活Nrf2等技術(shù)，闡明DPP-4i、ALA促腫瘤轉(zhuǎn)移的可能分子生物學(xué)機(jī)制。旨在明確DPP-4i與腫瘤生物學(xué)行為關(guān)聯(lián)，解析其可能的分子信號級聯(lián)機(jī)制，探索糖尿病合并腫瘤的合理用藥原則。
　　方法：
　　1.離體實(shí)驗(yàn)
　　1.1 DPP-4i對腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)觀察:沙格列汀(Saxaglip

5、tin，0.1μM)、西格列汀(Sitagliptin，0.6μM)處理腫瘤細(xì)胞;(1)Transwell、Transwell+基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移、侵襲能力;(2)活細(xì)胞工作站系統(tǒng)觀察細(xì)胞的定向遷移性，采用Image J分析細(xì)胞的定向性(persistence)及遷移指數(shù)（forward migrate index，F(xiàn)MI）。
　　1.2 DPP-4i對DPP-4酶活性、氧化應(yīng)激及Nrf2途徑的影響:(1)ELISA試劑盒檢測

6、DPP-4酶活性變化;(2)氧化應(yīng)激檢測:DCFH-DA探針ROS檢測;GSH/GSSG檢測:參照試劑盒說明書進(jìn)行（GSH and GSSG Assay Kit，碧云天），酶標(biāo)儀A412測吸光度;8-oxo-dG檢測:細(xì)胞預(yù)處理后多聚甲醛固定，熒光間接染色法標(biāo)記8-oxo-dG（Abcam）;(3) Nrf2與Ⅱ相解毒酶表達(dá)檢測:qRT-PCR檢測基因轉(zhuǎn)錄、免疫組化、Western Blot檢測蛋白表達(dá);(4)泛素化實(shí)驗(yàn)分析Keap1-

7、C151S對Sax誘導(dǎo)Nrf2激活的影響。
　　1.3 Western Blot檢測腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)，包括:(1)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白:HIF-1、VEGF、Cox-2;(2)淋巴轉(zhuǎn)移（結(jié)腸癌）相關(guān)蛋白:APRIL、BABMI;(3)血行轉(zhuǎn)移（肝癌）相關(guān)蛋白:Cortactin。
　　1.4 基因沉默、過表達(dá)/藥理(ALA、萊菔硫烷(sulforaphane，SF))激活Nrf2對腫瘤細(xì)胞相關(guān)表型的影響:(1)Transwell

8、、Transwell+基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移、侵襲能力;(2)活細(xì)胞工作站系統(tǒng)觀察細(xì)胞的定向遷移性，分析細(xì)胞的定向性(persistence)及遷移指數(shù)(FMI)。
　　1.5 基因沉默、過表達(dá)/藥理(ALA、SF)激活Nrf2對腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:免疫組化、Western Blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)，包括:HIF-1、VEGF、Cox-2 APRIL、BABMI、Cortactin等。
　　2.在體實(shí)驗(yàn)
　　2

9、.1 DPP-4i對腫瘤轉(zhuǎn)移作用的體內(nèi)研究:(1)雌性BALB/C-nu/nu裸小鼠8周時，分別通過尾靜脈、爪墊注射HuH-7-Luc+、HCT116-Luc+細(xì)胞建立肝癌、結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移模型。兩類模型均分為對照組、沙格列汀組(15mg/kg)、西格列汀組(120mg/kg)，三組分別以灌胃的方式、每日1次給予安慰劑、沙格列汀、西格列汀0.2ml，干預(yù)6周。(2)小動物活體成像觀察體內(nèi)腫瘤形成及轉(zhuǎn)移情況;(3) HE染色觀察肝臟、肺等器官腫

10、瘤轉(zhuǎn)移的組織形態(tài)學(xué)變化;(4)免疫組化、Westem Blot檢測肝、肺等組織Nrf2及其下游相關(guān)基因、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　2.2 基因沉默Nrf2對腫瘤轉(zhuǎn)移作用的體內(nèi)研究:雌性BALB/C-nu/nu裸小鼠8周時，尾靜脈注射HuH-7-Luc+細(xì)胞建立肝癌轉(zhuǎn)移模型。(1)隨機(jī)分為對照組、Nrf2 shRNA組，喂養(yǎng)3周，小動物活體成像觀察體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移情況;(2)對照組、Nrf2 shRNA組內(nèi)分別再分為Sax組(Sax1

11、5 mg/kg)、Sit組(Sit120 mg/kg)，藥物以灌胃的方式給予（藥物體積:0.2ml），干預(yù)3周。觀察指標(biāo)同2.1。
　　2.3 ALA、SF對腫瘤轉(zhuǎn)移作用的體內(nèi)研究:雌性BALB/C-nu/nu裸小鼠8周時，尾靜脈注射HuH-7-Luc+細(xì)胞建立肝癌轉(zhuǎn)移模型。隨機(jī)分為對照組、ALA組(80 mg/kg)或?qū)φ战M、SF組(10 mg/kg)，均以腹腔注射的方式給藥（藥物體積均為:0.2ml），干預(yù)3周。觀察指標(biāo)同2.

12、1。
　　3.人肝癌組織芯片免疫組化染色:對195例肝癌組織芯片（105例未轉(zhuǎn)移肝癌、69例發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移肝癌、2例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移肝癌、19例肝癌轉(zhuǎn)移病灶）免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行評分，分析Nrf2、GCLM的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.1 DPP-4i對腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)觀察:(1)Transwell、Transwell+基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)、活細(xì)胞工作站的結(jié)果提示Sax、Sit作用的腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力增加，且腫瘤細(xì)胞的定向

13、遷移能力顯著增加（persistence提高、FMI增加）。(2) Western Blot分析，Sax、Sit干預(yù)后腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)增加。
　　1.2 小動物活體成像結(jié)果顯示:Sax、Sit干預(yù)6周的肝癌、結(jié)腸癌腫瘤轉(zhuǎn)移模型裸小鼠體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移明顯增加;體重明顯減低;免疫組化及Western Blot結(jié)果顯示:DPP-4i干預(yù)的肝臟、肺組織中轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)水平升高。
　　1.3 氧化應(yīng)激檢測結(jié)果表明:DPP-4

14、i顯著降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS、8-oxo-dG水平，增加GSH/GSSG比例，提示:DPP-4i促腫瘤轉(zhuǎn)移可能與氧化應(yīng)激水平降低有關(guān)。
　　1.4 DPP-4i干預(yù)的腫瘤細(xì)胞及腫瘤模型肝臟、肺組織的Nrf2及其下游相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平顯著增加，提示:DPP-4i促腫瘤轉(zhuǎn)移可能與Nrf2上調(diào)有關(guān);泛素化實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，DPP-4i對Nrf2的激活可能與其抑制Keap1-C151S對Nrf2的降解實(shí)現(xiàn)的。
　　1.5 基因沉默N

15、rf2能夠顯著改善自發(fā)及DPP-4i誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞及肝癌轉(zhuǎn)移模型裸小鼠體內(nèi)腫瘤的轉(zhuǎn)移。
　　1.6 過表達(dá)/藥理(ALA、SF)激活Nrf2，腫瘤細(xì)胞及肝癌轉(zhuǎn)移模型裸小鼠體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移顯著增加。
　　1.7 對195例人肝癌組織芯片免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Nrf2、GCLM的蛋白表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移、分期密切相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　我們的研究結(jié)果表明，治療糖尿病藥物DPP-4i和ALA能夠通過抑制腫瘤中的Keap