PKD通過蛋白酶體通路增強(qiáng)HepG2細(xì)胞的放射敏感性.pdf

1、研究背景： 生物信息學(xué)分析表明乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）中存在與Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑高度同源的"Kunitz結(jié)構(gòu)域"，該結(jié)構(gòu)對其功能至關(guān)重要。HBx與絲氨酸蛋白酶的抑制因子競爭結(jié)合肝細(xì)胞來源的絲氨酸蛋白酶，擾亂細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的水解途徑，而行使其反式激活功能。蛋白酶體為普遍存在于真核生物、古菌、原核生物中的一類蛋白質(zhì)復(fù)合物。在真核生物中，蛋白酶體位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。蛋白酶體是細(xì)胞用來調(diào)控特定蛋白質(zhì)和除去錯(cuò)誤折疊蛋白

2、質(zhì)的主要機(jī)制。蛋白酶體降解途徑對于許多細(xì)胞進(jìn)程，包括細(xì)胞周期、基因表達(dá)的調(diào)控、氧化應(yīng)激反應(yīng)等，都是必不可少的。細(xì)胞周期進(jìn)程是由一系列細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）來進(jìn)行調(diào)控的，而CDK則是由細(xì)胞周期蛋白（cyclin）來激活。有絲分裂的細(xì)胞周期蛋白是所有已知的細(xì)胞內(nèi)蛋白中壽命最短的。在CDK-cyclin復(fù)合物行使了它的功能之后，復(fù)合物中的cyclin就會(huì)被多泛素化并由蛋白酶體降解，從而保證了細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)都能夠誘

3、導(dǎo)細(xì)胞凋亡或程序化細(xì)胞死亡，細(xì)胞內(nèi)部的組分發(fā)生解構(gòu)，這一過程主要是由特定的蛋白酶半胱天冬酶（caspase）來完成，但同時(shí)蛋白酶體在細(xì)胞凋亡過程中行使多種重要的作用。蛋白酶體的抑制作用可以影響不同類型細(xì)胞的調(diào)亡誘導(dǎo)，在大多數(shù)研究的細(xì)胞中，抑制蛋白酶體可以促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡。蛋白酶體抑制劑對于體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有有效的抗腫瘤活性，通過降解受調(diào)控的促生長細(xì)胞周期蛋白來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。因此一些蛋白酶抑制劑已被開發(fā)應(yīng)用于臨床的腫瘤治療。 研

4、究目的： 本研究合成與HBx的Kunitz結(jié)構(gòu)域序列相同的一肽段（PKD），探討其是否通過抑制蛋白酶體的活性、調(diào)控與蛋白酶體降解通路相關(guān)的VCP、細(xì)胞周期素和細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶等蛋白的表達(dá)，并由此對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和放射敏感性產(chǎn)生影響。 研究方法： 利用蛋白質(zhì)分析軟件Vector NTI6．0對HBx同源性進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)合成PKD的序列。利用固相多肽合成技術(shù)化學(xué)合成與HBx羧基端九個(gè)氨基酸

5、序列完全一致的肽段Phe-Val-Leu-Gly-Gly-Cys-Arg-His-Lys，探討其對HepG2細(xì)胞的作用。通過高壓液相色譜法（HPLC）和質(zhì)譜對純化后PKD再進(jìn)行鑒定。用MTT方法檢測PKD對HepG2細(xì)胞生長的影響：采用比色分析法檢測蛋白酶體的ATP酶活性；通過分析對不同肽酶特異性熒光肽底物L(fēng)LE-NA，LLVY-AMC和LSTR-AMC的水解，分析蛋白酶體的類胰凝乳蛋白酶、類胰蛋白酶和肽谷氨?；乃饷富钚?；利用Ali

6、gnX軟件對GenBank中VCP的同源性進(jìn)行分析，利用DNAStar7軟件分析VCP序列的特點(diǎn)，根據(jù)對其親水性結(jié)構(gòu)、柔韌區(qū)、抗原指數(shù)及表面概率結(jié)構(gòu)參數(shù)綜合分析，選擇人類VCP的637～647位和689～696位兩段序列，設(shè)計(jì)用于制備VCP抗體的19個(gè)氨基酸融合肽的序列GRLDQLIYIPLEICQRACK。 利用固相多肽技術(shù)合成VCP融合肽，將其與載體蛋白KLH偶聯(lián)形成VCP-KLH。利用常規(guī)免疫方案用VCP-KLH免疫BAL

7、B/c小鼠，制備VCP的多克隆抗體，再通過ELISA技術(shù)檢測其效價(jià)。利用實(shí)驗(yàn)所制備的鼠抗VCP抗體，進(jìn)行Western蛋白印跡，檢測VCP的表達(dá)。通過免疫組織化學(xué)法檢測HepG2細(xì)胞中P27，Cyclin E，Bax，Bcl-2，F(xiàn)as和Caspase-8的表達(dá)。利用利用熒光素（FITC）標(biāo)記的凋亡相關(guān)蛋白TFAR19單克隆抗體，對HepG2細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，觀察PKD對HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋

8、亡的改變。通過細(xì)胞照射及克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察PKD對HepG2細(xì)胞放射敏感性的影響。 研究結(jié)果： 合成的PKD肽Phe-Val-Leu-Gly-Gly-Cys-Arg-His-Lys純化后，經(jīng)HPLC檢測純度>97％，質(zhì)譜鑒定合成PKD的氨基酸組成和序列正確。 MTT方法檢測0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L和15mmol/L的PKD對HepG2細(xì)胞生長的影響，結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞的活力隨PK

9、D劑量增加呈現(xiàn)出降低的趨勢，15mmol/L的PKD有明顯的細(xì)胞毒性。 通過分析對不同肽酶特異性熒光肽底物L(fēng)LE-NA，LLVY-AMC和LSTR-AMC的水解，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞中10mmol/L的PKD可顯著地抑制蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性（p<0．05），但對其胰蛋白酶樣和肽-谷氨酰肽樣酶活性較糜蛋白酶樣活性相比抑制作用弱。此外進(jìn)一步觀察隨時(shí)間的變化，PKD對蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性影響的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)改變。PKD未作用的

10、蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性在12分鐘左右，反應(yīng)趨于高峰并漸趨平坦。10mmol/L的PKD則使蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性一直處于抑制狀態(tài)。 蛋白酶體的ATP酶活性為2．5h時(shí)限，利用抗蛋白酶體的抗體和偶聯(lián)有蛋白G瓊脂糖微球?qū)Φ鞍酌阁w復(fù)合體進(jìn)行免疫共沉淀。10mmol/L的PKD處理的HepG2細(xì)胞與未經(jīng)PKD處理的相比較，PKD顯著地抑制蛋白酶體復(fù)合體的ATP酶活性。 用ELISA法測定VCP融合肽抗血清的效價(jià)為1：1000

11、0。10mmol/L的PKD作用HepG2細(xì)胞36h后，收集細(xì)胞裂解，提取蛋白進(jìn)行Western蛋白印跡，分析VCP的表達(dá)。對于相同蛋白濃度的樣品，與未用PKD處理的HepG2細(xì)胞相比，PKD處理的HepG2細(xì)胞的Western蛋白印跡可見條帶（97kDa）的密度明顯減弱，表明PKD較明顯地抑制VCP的表達(dá)。 免疫組織化學(xué)法檢測HepG2細(xì)胞中P27，Cyclin E，Bax，Bcl-2，F(xiàn)as和Caspase-8的表達(dá)，結(jié)果顯

12、示經(jīng)10mmol/L的PKD作用于HepG2人肝癌細(xì)胞株后，P27蛋白的水平明顯升高，與空白對照組比較均有顯著性改變。PKD作用后的HepG2細(xì)胞中p27以胞核及核周出現(xiàn)棕黃色。PKD未作用的HepG2細(xì)胞沒有明顯的陽性著色。PKD上調(diào)P27在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)。 PKD合成肽處理的HepG2中大多數(shù)細(xì)胞Cylin E染色呈現(xiàn)陰性，其胞核不著色，細(xì)胞漿和細(xì)胞膜呈藍(lán)色。未經(jīng)PKD干預(yù)的H印G2其Cylin E蛋白表達(dá)明顯，主

13、要分布于核周圍的胞漿和細(xì)胞核內(nèi)，呈均勻的棕黃色細(xì)顆粒狀。PKD抑制HepG2細(xì)胞中周期蛋白質(zhì)Cyclin E的表達(dá)。 10mmol/L的PKD可明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞中Bax的表達(dá)，Bax蛋白呈深黃色染色、彌漫性或局限性分布于細(xì)胞漿，胞核藍(lán)染?？瞻讓φ盏腍epG2細(xì)胞呈陰性。PKD促進(jìn)HepG2細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)。 HepG2細(xì)胞均為Bcl-2陽性著色細(xì)胞，Bcl-2棕黃色顆粒狀，主要定位于胞漿中。10mmol/L

14、的PKD可完全抑制Bcl-2的表達(dá)，PKD處理后的HepG2細(xì)胞未見陽性染色。PKD抑制HepG2細(xì)胞中Bcl-2蛋白的過表達(dá)。 HepG2細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的陽性染色，但當(dāng)10mmol/L的PKD作用HepG2細(xì)胞后，陽性表達(dá)的Fas反應(yīng)物為棕黃色顆粒，分部于胞漿和胞膜。PKD提高HepG2細(xì)胞中Fas蛋白的表達(dá)。 與空白對照組的HepG2細(xì)胞相比較，10mmol/L的PKD可明顯增加HepG2細(xì)胞中Caspase-8的

15、表達(dá)，Caspase-8蛋白呈深黃色染色分散于胞漿和胞核。PKD誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中Caspase-8的表達(dá)。 本研究證實(shí)P27，Bax，F(xiàn)as和Caspase-8在10mmol/L PKD作用的HepG2細(xì)胞中表達(dá)明顯增高，但是cyclin E與Bcl-2的表達(dá)降低。10mmol/L PKD作用HepG2細(xì)胞36小時(shí)可致使細(xì)胞滯留于G0-G1期，并產(chǎn)生明顯的細(xì)胞凋亡，未處理的細(xì)胞則大部分進(jìn)入S期。利用熒光素（FITC）標(biāo)記的單

16、克隆抗體為探針，示蹤一新的凋亡相關(guān)分子TFAR19，PKD作用的HepG2細(xì)胞出現(xiàn)典型細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。5mmol/L PKD干預(yù)和空白對照組細(xì)胞在接受不同劑量的照射后，克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Sigma Plotll軟件以多靶單擊模型SF=1-（1-e-D/D0）n擬合細(xì)胞存活曲線，并計(jì)算細(xì)胞的放射敏感性參數(shù)。5mmol/LPKD增加HepG2細(xì)胞的放射敏感性30％（SERD0=1．34、SERDq=1．24、SERSF2=1．29）。