miR-18a增強(qiáng)肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞放射敏感性的研究.pdf

1、目前，隨著發(fā)病率和死亡率的不斷增加，癌癥已經(jīng)成為中國(guó)疾病致死的首要因素。最新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2015年中國(guó)有超過429.2萬新診斷的癌癥患者，超過281.4萬人因癌癥致死。肺癌是我國(guó)乃至全球最常見的惡性腫瘤，其總發(fā)病率和死亡率逐年上升，均居于惡性腫瘤第一位。放射治療是目前肺癌的主要治療手段之一。然而，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)尤其是肺腺癌細(xì)胞對(duì)放射線抗拒，導(dǎo)致肺癌患者放療后效果不佳。近年來，越來越多的研究證實(shí)，腫瘤干細(xì)胞(Cancer

2、stem cells，CSCs)是腫瘤放射抗拒的根源。因此，從腫瘤干細(xì)胞層面探索其放療抗拒的機(jī)制，為靶向殺傷腫瘤干細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，是未來基因-放射治療的新途徑。微小RNA(microRNA，miRNA)作為一種非編碼的RNA分子，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，發(fā)揮著促癌或抑癌的作用。并且，一些miRNAs參與調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的部分生物學(xué)功能，如腫瘤干細(xì)胞的自我更新、多向分化及放化療抵抗性等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-18a在CD133+

3、肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中低表達(dá)，而miR-18a可提高普通肺腺癌細(xì)胞(A549)的放射敏感性。那么，miR-18a能否調(diào)控肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞放射敏感性呢，能否作為放射線靶向靶傷肺腺癌干細(xì)胞的分子靶點(diǎn)呢？本項(xiàng)目擬從miR-18a入手，探索其在CD133+肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中表達(dá)高低與CD133+肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞放射敏感性之間的關(guān)系。
　　目的:探討miR-18a在肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞放射線抗拒中的作用及其調(diào)控機(jī)制，探索miR-18a作為

4、增敏放射線靶向殺傷腫瘤干細(xì)胞的分子靶點(diǎn)的可能性。
　　方法:1、利用紫杉醇及無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞的成球生長(zhǎng)，獲得肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分選出CD133+細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng);利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chainreaction，qRT-PCR)、成球?qū)嶒?yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)等對(duì)

5、CD133+細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞相關(guān)特性驗(yàn)證;利用放射線照射CD133+及CD133-細(xì)胞，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆形成能力;qRT-PCR檢測(cè)CD133+及CD133-細(xì)胞中miR-18a表達(dá)水平;構(gòu)建miR-18a慢病毒(Lentivirus，LV)過表達(dá)體系，并轉(zhuǎn)染CD133+細(xì)胞，分為miR-18a慢病毒轉(zhuǎn)染組(miR-18a-LV)、空載體轉(zhuǎn)染組(EV)及空白對(duì)照組(Blank)，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞干性相關(guān)基因表達(dá)情況以及mi

6、R-18a表達(dá)情況，并檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞成球能力;傳代培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定傳代的miR-18a過表達(dá)CD133+細(xì)胞，不同劑量放射線照射轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞，分為miR-18a-LV組、EV組及Blank組，進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，計(jì)算克隆形成數(shù)目及存活分?jǐn)?shù)，描計(jì)細(xì)胞存活曲線并計(jì)算D0、 Dq、SF2等放射生物學(xué)參數(shù)。
　　2、利用網(wǎng)絡(luò)資源在線分析軟件，PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/PicTar)，

7、TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_50/)和miRanda(http://www.microma.org/)等預(yù)測(cè)miR-18a的靶基因（乏氧誘導(dǎo)因子1，HIF-1α）;運(yùn)用雙熒光素酶系統(tǒng)、qRT-PCR、Westen Blot等實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證miR-18a對(duì)HIF-1α的負(fù)調(diào)控作用;利用慢病毒載體建立miR-18a過表達(dá)A549細(xì)胞系，裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證miR-18a增強(qiáng)放射線對(duì)移植瘤的

8、殺傷效應(yīng);qRT-PCR、Western blot檢測(cè)移植瘤組織miR-18a、HIF-1α表達(dá)情況。
　　3、收集NSCLC患者放療前血漿樣本，qRT-PCR檢測(cè)患者放療前血漿中miR-18a表達(dá)情況，以Cel-39為外參照，分析miR-18a表達(dá)高低與患者放療療效之間的相關(guān)性，并通過ROC曲線計(jì)算miR-18a最佳分界值(cut-off);以miR-18a分界值為標(biāo)準(zhǔn)，分析miR-18a不同表達(dá)水平兩組NSCLC患者在放療反應(yīng)

9、性即客觀緩解率(ORR)、無進(jìn)展生存期(PFS)、總生存時(shí)間(OS)的差異，并計(jì)算miR-18a分界值預(yù)測(cè)放療療效的敏感性、特異性。
　　結(jié)果:1、無血清培養(yǎng)基成功誘導(dǎo)了克隆形成的肺腺癌細(xì)胞，流式細(xì)胞分選后獲得了CD133+的細(xì)胞群，干性相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示其具有干細(xì)胞特征;克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示CD133+細(xì)胞克隆形成能力高于CD133-細(xì)胞(P＜0.05);qRT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示CD133+細(xì)胞中miR-18a表達(dá)水平低于CD133-細(xì)

10、胞(P＜0.05);通過慢病毒表達(dá)體系，獲得了miR-18a穩(wěn)定過表達(dá)的CD133+細(xì)胞;放射線存活曲線顯示，miR-18a過表達(dá)可增強(qiáng)CD133+細(xì)胞放射線敏感性，D0、Dq、SF2等放射生物學(xué)參數(shù)均下降(P＜0.05)。
　　2、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示miR-18a與HIF-1α基因3'-UTR相結(jié)合，發(fā)揮直接調(diào)控作用;Westen Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-18a過表達(dá)，可阻斷A549細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)量(P＜0.0

11、5);放射線照射可下調(diào)A549細(xì)胞miR-18a表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)HIF-1α基因和蛋白表達(dá);裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，miR-18a輻照組移植瘤的腫瘤體積小、生長(zhǎng)速度慢(P＜0.05)，移植瘤中miR-18a表達(dá)較高，HIF-1α基因和蛋白表達(dá)較低。
　　3、54例NSCLC患者放療前血漿標(biāo)本，qRT-PCR檢測(cè)顯示:放療有效組(CR+PR)血漿miR-18a水平顯著高于放療耐受組(SD+PD)組(P＜0.05);ROC

12、曲線顯示miR-18a/Cel-39最佳分界值為2.28;以miR-18a/cel-39＞2.28為參考值，miR-18a高表達(dá)組放療后ORR優(yōu)于miR-18a低表達(dá)組(87％ vs6％，P＜0.05)，中位PFS無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(8.1m vs6.5m，P＞0.05)，中位OS也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(18.7m vs15.5m，P＞0.05);以miR-18a/cel-39＞2.28為參考值，預(yù)測(cè)放療療效的敏感性為87％、特異性為95％。