佛波酯增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞株順鉑敏感性的研究.pdf

1、目的：肺癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,它的發(fā)病率和死亡率己躍居各種惡性腫瘤的首位,目前含鉑的化療方案己被公認(rèn)為是肺癌化療的一線方案。然而在臨床上,多數(shù)患者經(jīng)初次化療后,甚至有部分患者在第一次化療時(shí),肺癌細(xì)胞就對(duì)順鉑產(chǎn)生了耐藥性,影響了治療效果,導(dǎo)致化療失敗。如何逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥、增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,提高化療的效果是臨床上亟待解決的問(wèn)題。12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol

2、-13-acetate,TPA)是佛波酯類(lèi)化合物中活性較高的一種,是蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的高親和力物質(zhì)。TPA通過(guò)激活PKC可以產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng),比如刺激或抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)分化、激活核轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞表面受體、腫瘤促發(fā)等。已有研究表明TPA能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的分化而降低其惡性程度,還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,如在人宮頸癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞等,而在肺腺癌細(xì)胞尚無(wú)報(bào)道。本課題擬采用體外培養(yǎng)A549及其耐順

3、鉑細(xì)胞株A549/CP為研究對(duì)象,探討TPA能否增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)一步研究,為臨床肺癌的治療尋找新的途徑和方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴細(xì)胞培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞株A549用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃溫度,5%CO2飽和濕度的無(wú)菌培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng),每天觀察一次視情況傳代,平均每三天傳代一次。A549/CP細(xì)胞在培養(yǎng)基中加入2μg/ml的順鉑,其它培養(yǎng)條件同A549細(xì)胞。⑵TPA單用

4、及聯(lián)合順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖的影響采用MTT比色法檢測(cè)兩藥單用及聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制的變化,繪制量效曲線,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,評(píng)價(jià)TPA對(duì)順鉑抗腫瘤作用的影響。⑶TPA對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)鉑離子濃度的影響用無(wú)焰原子吸收法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)鉑離子濃度的變化。⑷TPA對(duì)細(xì)胞Na+,K+-ATP酶活性及其亞基表達(dá)水平的影響分別以Na+,K+-ATP酶活性檢測(cè)試劑盒和Western Blotting法檢測(cè)TPA對(duì)兩種細(xì)胞株Na+,K+-ATP酶活性和Na+,

5、K+-ATP酶亞基表達(dá)水平的影響。
　　 結(jié)果：①TPA對(duì)細(xì)胞增殖的影響。TPA在1.6 nM和8.1 nM的濃度TPA對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用,而16.2nM及其以上濃度TPA對(duì)細(xì)胞有明顯增殖抑制作用,呈劑量依賴(lài)性。②TPA增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性。A549細(xì)胞,藥物作用24小時(shí)CP單用組分別與1.6nM TPA聯(lián)合組、8.1nMTPA聯(lián)合組相比IC50分別下降62%和69%(P＜0.01,與CP組比較),增敏倍數(shù)分別為2.6、3.2

6、;藥物作用48小時(shí)CP單用組分別與1.6nM TPA聯(lián)合組、8.1nMTPA聯(lián)合組相比IC50分別下降67%和68%(P＜0.01,與CP組比較),增敏倍數(shù)分別為3.0、3.1;藥物作用72小時(shí)CP單用組分別與1.6nM TPA聯(lián)合組、8.1nMTPA聯(lián)合組相比IC50分別下降55%和63%(P＜0.01,與CP組比較),增敏倍數(shù)分別為2.2、2.7;藥物作用96小時(shí)CP單用組分別與1.6nM TPA聯(lián)合組、8.1nMTPA聯(lián)合組相比I

7、C50分別下降74%和77%(P＜0.01,與CP組比較),增敏倍數(shù)分別為3.8、4.4。A549/CP細(xì)胞,藥物作用24小時(shí)和48小時(shí)CP單用組分別與1.6nM TPA聯(lián)合組、8.1nM TPA聯(lián)合組相比IC50值統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著差異;藥物作用72小時(shí)CP單用組分別與1.6nM TPA聯(lián)合組、8.1nM TPA聯(lián)合組相比IC50分別下降23%和17%(P＜0.05,與CP組比較),增敏倍數(shù)分別為1.3、1.2;藥物作用96小時(shí)CP單用組分別

8、與1.6nM TPA聯(lián)合組、8.1nM TPA聯(lián)合組相比IC50分別下降67%和69%(P＜0.01,與CP組比較),增敏倍數(shù)分別為3.0、3.2。③TPA對(duì)順鉑在胞內(nèi)蓄積的影響。A549胞內(nèi)鉑離子濃度隨著順鉑劑量的增加而增加呈劑量依賴(lài)性,1.6nM、8.1nM TPA處理組在10gg/ml、20μg/ml、30μg/ml順鉑作用兩小時(shí)后其胞內(nèi)鉑離子濃度均增加一倍以上,顯著高于CP組(P＜0.01);TPA+哇巴因組分別同TPA各處理組

9、相比胞內(nèi)鉑離子濃度下降75%以上(P＜0.01)。A549/CP胞內(nèi)鉑離子濃度隨著順鉑劑量的增加而增加呈劑量依賴(lài)性,1.6nM、8.1nM TPA處理組在10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml順鉑作用兩小時(shí)后其胞內(nèi)鉑離子濃度均增加一倍以上,顯著高于CP組(P＜0.01);TPA+哇巴因組分別同TPA各處理組相比胞內(nèi)鉑離子濃度下降77%以上(P＜0.01)。④TPA對(duì)順鉑從細(xì)胞內(nèi)流出的影響。A549、A549/CP細(xì)胞株與含30μ

10、g/ml順鉑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時(shí)后,立即更換為新鮮無(wú)順鉑培養(yǎng)基。分別考察30min、60min、120min后TPA處理組與對(duì)照組中胞內(nèi)所剩余的鉑離子濃度百分比進(jìn)行比較,TPA處理組與正常對(duì)照組細(xì)胞胞內(nèi)鉑離子含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。⑤TPA對(duì)Na+,K+-ATP酶活性的影響。A549/CP細(xì)胞Na+,K+-ATP酶活性顯著低于A549細(xì)胞(P＜0.05),TPA能夠顯著增強(qiáng)A549、A549/CP細(xì)胞的Na+,K+-ATP酶活性(P＜0.05