靶向抑制DNA修復基因Artemis增強腫瘤細胞放射敏感性的研究.pdf

1、研究背景：
　　 放射治療是現(xiàn)代腫瘤治療的主要手段之一,但大多數(shù)惡性腫瘤存在不同程度的放射抗拒性,嚴重影響了放射治療的療效?？朔@種放射抵抗性對改善腫瘤放射治療效果具有重要臨床意義。腫瘤細胞對放射線的敏感性主要取決于修復DNA損傷的能力。腫瘤細胞和正常細胞之間存在DNA修復機制的差異也提示DNA損傷修復蛋白是腫瘤放射增敏治療的優(yōu)秀靶點。從分子機制上來說,電離輻射(IR)對細胞的主要致死性損傷為DNA雙鏈斷裂(DSBs)。DSBs

2、不能修復或錯誤修復會導致染色體缺失、變異最終發(fā)生細胞死亡。在哺乳動物細胞,DSBs主要通過非同源末端連接(NHEJ)途徑進行修復,并且伴隨著由ATM啟動的多種信號通路反應,調(diào)節(jié)細胞周期阻滯等,以便協(xié)助修復。NHEJ途徑至少涉及7個主要成員的協(xié)同作用,DNA-PKcs,KLJ70／KLJ80,Artemis,XRCC4,DNA連接酶Ⅳ,XLF。、NHEJ蛋白的任一成員的缺陷或失活均表現(xiàn)為DSBs修復缺陷而引起的對IR敏感性的增加。抑制NH

3、EJ修復途徑和ATM依賴的修復反應來增加腫瘤細胞的放射敏感性已有研究但仍很滯后,需做不斷的研究和革新。Artemis是目前研究最熱門的NHEJ修復分子。它的突變或缺陷會導致人類放射敏感性嚴重聯(lián)合免疫缺陷(RS-SCID)綜合癥,表現(xiàn)為V(D)J重組障礙而致免疫功能缺陷,以及對離子射線嚴重的敏感性。研究表明,IR誘導的DSBs損傷修復中,Artemis受DNA-PKcs的調(diào)節(jié)參與復雜染色體斷端的處理,受ATM的調(diào)節(jié)參與染色質(zhì)重構和端粒維持

4、,細胞周期檢查點調(diào)控等方面的細胞修復反應。因此,Artemis在IR誘導的DSBs的修復反應中,不僅是效應器也是信號傳遞分子,其在整合DNA損傷信號通路,細胞反應和DNA修復方面具有獨特的關鍵性作用。Artemis在DSBs修復中的重要作用解釋了Artemis缺陷細胞對IR的高敏感性,同時也提示Artemis可以作為放射增敏的新靶點。然而,目前對于抑制Artemis在增加腫瘤細胞放射敏感性方面所起的作用及相關機制尚無開展,在本研究中,我

5、們對此進行了探索,并且提出了Artemis作為腫瘤放射增敏治療靶點的潛在價值和臨床意義。
　　 實驗方法及結果：
　　 1、Artemis在人類結直腸癌中的表達及與其放射敏感性的相關性研究。
　　 研究Artemis在腫瘤內(nèi)的表達情況及與放射敏感性之間的相關性對于建立以Artemis為靶點的放射增敏的策略是非常必要的。我們以50例臨床獲取的人類結直腸癌組織及癌旁正常組織樣本為研究對象,通過定量PCR的方法,評估了

6、Artemis在癌及癌旁組織中的表達情況,發(fā)現(xiàn)了28％的結腸癌組織中Artemis是高表達的,然后又在多個腸癌細胞系,使用定量PCR及克隆生存實驗等評估了Artemis表達水平及其對放射線的敏感性,發(fā)現(xiàn)了二者之間存在的相關性,建立了Artemis作為放射增敏靶點的必要性及潛在價值。
　　 2、慢病毒介導的RNAi技術靶向抑制Artemis表達增強腸癌細胞的放射敏感性及相關機制研究
　　 Artemis亞等位基因造成的Ar

7、temis的顯著低水平表達的細胞表現(xiàn)出類似于Artemis缺陷細胞的高放射敏感性,這也提示靶向沉默Artemis可能可以增加對放射線的敏感性。因此,我們篩選了可以有效沉默Artemis的siRNA靶點,并構建入慢病毒載體,借此沉默了人結直腸癌細胞系RKO細胞的Artemis蛋白,然后通過克隆生存實驗及MTT實驗并結合裸鼠體內(nèi)實驗證實了沉默Artemis的RKO細胞對IR以及其他DNA損傷劑的敏感性明顯的增加。使用γ H2AX焦點分析法檢

8、測了Artemis沉默RKO細胞的DSBs修復動力學的改變,證明了其DNA損傷修復的損害發(fā)生在8小時之后的慢修復通路,表現(xiàn)了與Artemis缺陷細胞相似的表型。最后通過各種凋亡檢測方法及免疫印跡的方法證明沉默Artemis對RKO細胞在DNA損傷劑誘導下發(fā)生了更多的凋亡事件,其中涉及了p53／p21通路相關的凋亡信號通路。
　　 3、 Anemis顯性失活突變體對腫瘤細胞的放射增敏作用及相關機制的研究。
　　 失活基因的

9、方法除了siRNA干擾以外,還有一種引入顯性失活突變體的方法。顯性失活突變的方法比siRNA更加特異,適用范圍更廣泛。Artemis的一些突變體形式具有顯性失活作用已有報道?；趯rtemis蛋白結構和功能調(diào)節(jié)的深刻理解的基礎之上,在本研究中,我們通過基因克隆的方法構建了C末端缺失且無核酶活性的Artemis突變體并將其過表達在放射抗拒腫瘤細胞系HeLa中,使用克隆生存分析法及MTT法,證明了Artemis突變體可以增加腫瘤細胞對DN

10、A損傷劑的敏感性,并使用γ H2AX焦點分析證明其對DNA修復的影響是類似于Artemis缺陷細胞的,最后通過免疫共沉淀及磷酸化分析證明了Artemis突變體具有競爭結合Artemis上游蛋白DNA-PKcs和ATM的能力而損害了內(nèi)源性Artemis的磷酸化過程,因而可能損害了Artemis相關的細胞DNA損傷修復反應。
　　 結論：
　　 1、首次研究了Artemis在腫瘤組織內(nèi)的表達情況,證明了Artemis表達在不

11、同的組織間存在明顯的異質(zhì)性,部分結直腸癌腫瘤組織內(nèi)Artemis的表達高于癌旁正常組織,而且腫瘤細胞內(nèi)高水平的Artemis表達與其放射抗拒存在一定的相關性,我們提出在Artemis高表達且放射線抗拒的結直腸癌,靶向抑制Artemis增強腫瘤對放射線的敏感性且利于降低周圍組織損傷的治療策略有重要臨床意義。
　　 2、構建了具有高干擾效率Artemis慢病毒RNAi載體,在目的細胞沉默了Artemis蛋白,然后在體內(nèi)體外實驗均證明

12、了靶向沉默Artemis蛋白可以增加腫瘤細胞對IR及DNA損傷劑CPT等的敏感性,其中涉及p53／p21相關凋亡通路的參與。這是國際上首次通過靶向抑制Artemis表達而調(diào)節(jié)了腫瘤放射敏感性的研究,它為臨床上治療放療抵抗或化療抵抗的結直腸癌提供改善治療效果的新策略。
　　 3、構建了人Artemis蛋白的突變體質(zhì)粒載體,證明了過表達突變體Artemis可以增加腫瘤細胞對IR及DNA損傷劑Etoposide的敏感性,用顯性失活的方