HCV NS3蛋白通過增強(qiáng)PPM1A的泛素-蛋白酶體途徑降解促進(jìn)肝癌發(fā)展的機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，它被列為全球第5大惡性腫瘤和第2大癌癥死亡原因，每年可導(dǎo)致約70萬人死亡。慢性丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染是肝癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一，一直以來HCV相關(guān)肝癌發(fā)生的機(jī)制都是醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)，雖然已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但具體機(jī)制仍不完全清楚。
　　不同于乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，H

2、BV）的致病機(jī)制，HBV是一種DNA病毒，其基因組能夠插入宿主細(xì)胞基因組引起插入突變，并且具有反式激活功能的HBV X蛋白是一個明確的致癌蛋白。HCV是一種單鏈RNA病毒，其所有生命活動局限于細(xì)胞質(zhì)中，HCV不能夠引起插入突變，也沒有明確的致癌基因。雖然HCV持續(xù)感染引起的慢性炎癥可能有助于肝癌的發(fā)生，但越來越多的證據(jù)表明，HCV可通過其編碼產(chǎn)生的蛋白與宿主細(xì)胞蛋白的相互作用，來參與并改變包括細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、凋亡等眾多細(xì)胞生命活

3、動，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。
　　金屬依賴型蛋白磷酸酶1A（Protein Phosphatase Magnesium Dependent1A，PPM1A），又名PP2Cα，是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶PP2C家族的最具特征性成員。最近的研究表明，PPM1A能夠靶向并去磷酸化TGF-β/smad，Wnt/β-catenin，MAPK，PI3K/Akt和NF-κB等多個與腫瘤發(fā)生相關(guān)的信號通路的關(guān)鍵分子，因而具有抑制腫瘤發(fā)生和抑制腫

4、瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的功能。然而，HCV感染對PPM1A的表達(dá)，以及PPM1A在HCV相關(guān)HCC的中的作用還未見報(bào)道。
　　本研究旨在探討HCV感染對PPM1A的表達(dá)影響及其機(jī)制，以及PPM1A在HCV相關(guān)HCC的發(fā)生中的作用。我們檢測了HCV感染對PPM1A的表達(dá)和細(xì)胞定位的影響，并且在HCV相關(guān)HCC病人癌組織和癌旁組織中驗(yàn)證了PPM1A的表達(dá)；在體外細(xì)胞培養(yǎng)體系中揭示了HCV復(fù)制及其編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白3（non-struct

5、ural protein3，NS3）對PPM1A的表達(dá)的影響以及相關(guān)的分子機(jī)制；通過體外的功能實(shí)驗(yàn)，明確了NS3和PPM1A在HCC發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。我們的研究由以下三部分組成：
　　第一部分 HCV感染下調(diào)表達(dá)PPM1A的表達(dá)
　　目的：探索在細(xì)胞培養(yǎng)體系中，HCV感染對PPM1A的表達(dá)和細(xì)胞定位的影響，以及PPM1A在HCV相關(guān)的HCC癌組織和癌旁組織的表達(dá)與正常肝組織的表達(dá)差異。
　　方法：用體外細(xì)胞培養(yǎng)

6、來源的HCV（cell culture-derived HCV particles，HCVcc），感染高度容許HCV復(fù)制的肝癌細(xì)胞系（highly permissive hepatoma cell line）Huh-7細(xì)胞0-5天，western blotting檢測HCV感染對PPM1A總蛋白及其分別在胞漿和胞核分布的影響，并用免疫熒光的方法檢測HCV復(fù)制對PPM1A的細(xì)胞定位的影響。用免疫組化的方法檢測正常肝組織，HCV相關(guān)HCC癌

7、組織和癌旁組織中PPM1A的表達(dá)和細(xì)胞定位。
　　結(jié)果：在體外HCV感染細(xì)胞模型中，隨HCV感染時間的增加，PPM1A總蛋白含量、胞核蛋白含量顯著降低，胞漿蛋白有一定程度的增加。免疫熒光結(jié)果顯示，正常情況下，PPM1A主要定位于細(xì)胞核，HCV感染可導(dǎo)致PPM1A由細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，且總的熒光強(qiáng)度降低。同時，在正常肝組織中，PPM1A表達(dá)量較高，且胞核胞漿均有分布，但以胞核為主；但在HCV相關(guān)的HCC的癌組織和癌旁組織中，PPM1A

8、表達(dá)較正常組織顯著下降，細(xì)胞核中幾乎檢測不到PPM1A的陽性著色。
　　結(jié)論：無論是在體外細(xì)胞培養(yǎng)體系中，還是在肝癌組織中，HCV的感染都會導(dǎo)致PPM1A的表達(dá)量的降低和細(xì)胞定位的改變。
　　第二部分 HCV NS3蛋白促進(jìn)PPM1A的泛素-蛋白酶體途徑降解
　　目的：探討HCV感染導(dǎo)致PPM1A表達(dá)下降的具體機(jī)制。
　　方法：HCV RNA可編碼10種不同的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，HCV感染導(dǎo)致PPM1A表達(dá)下降

9、具體是其中一種或幾種蛋白所致尚不明確。我們將10個HCV編碼蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒（core、P7、E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）分別瞬時轉(zhuǎn)染到Huh-7細(xì)胞系中，檢測HCV編碼的蛋白對PPM1A表達(dá)的影響；NS3絲氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)突變質(zhì)粒NS3S139A的轉(zhuǎn)染表達(dá)來分析NS3的蛋白酶活性是否是NS3降低PPM1A的表達(dá)所必需；免疫熒光分析NS3對PPM1A細(xì)胞定位的影響；免疫共沉淀技術(shù)分析Huh-7

10、和293T細(xì)胞內(nèi)NS3與PPM1A的相互作用，并分別構(gòu)建了NS3的蛋白酶結(jié)構(gòu)域（NS3-protease）和解旋酶結(jié)構(gòu)域（NS3-helicase）的截短蛋白質(zhì)粒，來分析其與PPM1A相互作用的結(jié)構(gòu)域。最后，系統(tǒng)分析NS3對PPM1A蛋白表達(dá)的影響的具體機(jī)制，分別從mRNA水平，蛋白水平分析NS3對PPM1A表達(dá)的影響，采用蛋白質(zhì)合成抑制劑，泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）和自噬溶酶

11、體途徑（autophagy-lysosome pathway，ALP）阻斷劑來分析PPM1A表達(dá)降低的具體機(jī)制，采用免疫沉淀技術(shù)來分析PPM1A的泛素化水平。
　　結(jié)果：HCV表達(dá)的NS3蛋白能夠顯著降低PPM1A的表達(dá)并改變PPM1A的細(xì)胞定位，并且此效應(yīng)不依賴于NS3的絲氨酸蛋白酶的切割作用。在Huh-7和293T細(xì)胞內(nèi)NS3能夠與PPM1A相互作用，截短蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染分析進(jìn)一步表明，NS3與PPM1A相互作用的區(qū)域是NS3的蛋

12、白酶結(jié)構(gòu)域（NS3-protease）。HCV感染和NS3的表達(dá)不僅不能夠降低，相反卻顯著增加了PPM1A mRNA的表達(dá)，這表明NS3是通過轉(zhuǎn)錄后水平來影響PPM1A的表達(dá)的。使用蛋白合成抑制劑放線菌酮（cycloheximide，CHX）阻斷PPM1A的蛋白合成后，NS3能夠隨時間推移顯著降低PPM1A的表達(dá)，表明NS3能夠影響PPM1A蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。分別使用UPP和ALP的抑制劑MG132和氯喹（chloroquine）阻斷UP

13、P和ALP后，發(fā)現(xiàn)UPP抑制劑MG132能夠顯著回復(fù)NS3導(dǎo)致的PPM1A的降低，這表明NS3是通過促進(jìn)PPM1A的UPP降解來降低PPM1A的表達(dá)的。最后，免疫沉淀結(jié)果顯示，HCV感染和NS3的表達(dá)能顯著增加PPM1A的泛素化水平。
　　結(jié)論：HCV的NS3蛋白能夠與PPM1A相互作用，并促進(jìn)PPM1A的泛素-蛋白酶體途徑降解，此功能依賴于NS3的蛋白酶結(jié)構(gòu)域。
　　第三部分 PPM1A介導(dǎo)NS3的促癌作用
　　目的

14、：探索NS3、PPM1A在HCC侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。
　　方法：將PPM1A siRNA轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞，采用劃痕實(shí)驗(yàn)（wound healing）和transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分析敲除PPM1A對肝癌細(xì)胞侵襲（invasion）和遷移（migration）的影響。分別轉(zhuǎn)染對照、NS3、NS3與PPM1A野生型、NS3與PPM1A去磷酸化酶活性位點(diǎn)突變型（PPM1A D239N）質(zhì)粒，來分析NS3的表達(dá)和PPM1A的“拯救”表達(dá)對

15、肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。通過檢測vimentin，N-和E-cadherin的表達(dá)水平，來確定各因素對Huh-7細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響。
　　結(jié)果：與對照相比較，NS3的表達(dá)和PPM1A的敲除均顯著增加了Huh-7細(xì)胞的侵襲和遷移的能力以及EMT。TGF-β1的加入，同時促進(jìn)了對照和PPM1A敲除細(xì)胞的侵襲和遷移的能力，但是對PPM1A敲除細(xì)胞的促進(jìn)