自噬溶酶體通路及泛素蛋白酶體通路在肝癌藥物干預(yù)中的相關(guān)作用研究.pdf

1、前言：原發(fā)性肝癌(以下簡稱肝癌)是中國最常見的惡性腫瘤之一，每年全世界新發(fā)肝癌病例的55％發(fā)生在我國，而大部分肝癌病人在診斷明確1年內(nèi)死亡。其原因在于很多腫瘤到晚期時(shí)才被發(fā)現(xiàn)，而此時(shí)已經(jīng)無法根治性切除。因此這些病人只能選擇化療、放療或者介入治療，但是效果卻很差，五年生存率僅為7％。而對于曾行根治性切除術(shù)的肝癌患者，術(shù)后的高復(fù)發(fā)率也需要積極有效的藥物輔助治療才能達(dá)到更佳的臨床療效。
　　 然而肝癌的藥物治療進(jìn)展一直不大，單藥治療有

2、效率低，且毒副作用大。近年來，一些新型藥物如口服5-FU的前體藥物卡培他濱、第三代鉑類藥物奧沙利鉑等相繼成功用于臨床，使肝癌的化療出現(xiàn)了新的進(jìn)展。而隨著分子靶向型藥物如索拉非尼(Sorafenib)的出現(xiàn)，肝癌的藥物治療更是呈現(xiàn)出新的局面。然而盡管如此，大宗的隨機(jī)分組臨床研究報(bào)道這些藥物也僅能延長晚期肝癌患者很短的生存期。因此發(fā)展新的化療藥物或化療策略進(jìn)一步提高肝癌療效已是當(dāng)務(wù)之急。
　　 進(jìn)展期腫瘤的一個(gè)重要特點(diǎn)是旺盛的蛋白質(zhì)

3、合成和降解，兩者對腫瘤的生長都必不可少。泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)和自噬溶酶體系統(tǒng)(autophagy-lysosomal system，autophagy)是真核細(xì)胞內(nèi)兩條主要的蛋白質(zhì)降解途徑。前者主要負(fù)責(zé)降解信號分子、腫瘤抑制因子、細(xì)胞周期蛋白、凋亡抑制因子等。蛋白酶體抑制劑(proteasome inhibitors)通過抑制蛋白酶體的功能，干擾細(xì)胞原有的增殖、分化和凋亡過程

4、，可以優(yōu)先在惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，使人們逐漸意識到其抗腫瘤的潛能。近年來，蛋白酶體抑制劑發(fā)展迅速，硼酸肽類藥物硼替佐米(bortezomib)已用于臨床多發(fā)性骨髓瘤的治療。但是蛋白酶體抑制劑在實(shí)體瘤的應(yīng)用發(fā)展緩慢，在肝癌方面研究極少。
　　 抵抗化療藥物誘導(dǎo)的凋亡是腫瘤細(xì)胞的重要特性之一，也是導(dǎo)致其耐藥或者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要原因。有研究提示另外一條蛋白質(zhì)降解通路：自噬溶酶體蛋白降解通路(簡稱自噬通路或自噬溶酶體通路)在體內(nèi)激活

5、并作為細(xì)胞的一種保護(hù)機(jī)制可能在其中起了重要作用。凋亡通路和自噬通路的信號途徑相互交錯(cuò)影響，相互依存，因此決定腫瘤細(xì)胞的命運(yùn)。所謂自噬溶酶體通路是以細(xì)胞內(nèi)雙層或多層膜樣結(jié)構(gòu)包裹胞漿或細(xì)胞器形成自噬小泡為形態(tài)學(xué)特征，然后通過與細(xì)胞內(nèi)溶酶體融合而降解囊泡內(nèi)容物。自噬溶酶體通路是細(xì)胞內(nèi)除了泛素蛋白酶體通路以外最重要的降解體系，負(fù)責(zé)降解長壽蛋白質(zhì)、老化細(xì)胞器、RNA及其它大分子，生命體借此維持代謝平衡及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。因此人們認(rèn)為自噬溶酶體通路通過降

6、解陳舊細(xì)胞器或者長壽蛋白，有利于腫瘤細(xì)胞逃避缺乏營養(yǎng)或者藥物治療等應(yīng)激環(huán)境。相反如果抑制了自噬通路，則會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞大量死亡。同時(shí)也有研究認(rèn)為過度上調(diào)的自噬通路可以引起細(xì)胞內(nèi)蛋白過度降解而死亡，即“自噬性細(xì)胞死亡”，也稱為Ⅱ型程序化細(xì)胞死亡。因此調(diào)控自噬通路有望成為進(jìn)一步提高藥物療效新的途徑。
　　 本課題分別從肝癌細(xì)胞系、肝癌裸鼠模型和肝癌臨床組織樣本三個(gè)水平，深入研究藥物直接激活肝癌自噬溶酶體通路的現(xiàn)象及機(jī)制，探索自噬、自噬

7、性細(xì)胞死亡及凋亡在藥物干預(yù)治療中的交互作用及其分子機(jī)制。同時(shí)初步探索細(xì)胞內(nèi)兩條蛋白降解通路之間的交互影響，了解蛋白酶體抑制劑在肝癌應(yīng)用中的可行性和方法學(xué)，最終為肝癌的藥物治療提供新的選擇，為聯(lián)合用藥提供理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步提高肝癌的化療療效提供新的思路。
　　 第一部分、自噬溶酶體通路在蛋白酶體抑制劑抗肝癌中的體外研究
　　 包括肝癌等惡性腫瘤中都存在泛素蛋白酶體蛋白通路變異，將泛素蛋白酶體通路作為干預(yù)靶點(diǎn)是治療惡性腫瘤

8、新的方向，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)自噬溶酶體通路與泛素蛋白酶體通路可能存在互補(bǔ)代償?shù)年P(guān)系。本部分?jǐn)M在體外初步探索阻斷泛素蛋白酶體通路后對肝癌的抗腫瘤作用，了解自噬溶酶體通路與泛素蛋白酶體通路在體外的客觀聯(lián)系，并進(jìn)一步明確自噬溶酶體通路在蛋白酶體抑制劑抗肝癌中所發(fā)揮的確切作用。
　　 選用兩種不同類別的蛋白酶體抑制劑MG-132(醛肽類)和bortezomib(硼酸肽類)，兩種不同作用機(jī)制的自噬抑制劑3-methyladenine(3-MA)

9、和chloroquine(CQ)，選用三種具有不同凋亡抵抗和侵襲轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系：MHCC-97H，PLC/PRF/5和Huh-7(MHCC-97H>PLC/PRF/5>Huh-7)。用MTT法檢測增殖；Hoechst33342染色并.Annexin-V-FITC和propidium iodide(PI)雙染，流式細(xì)胞儀分析檢測凋亡；用Western blot檢測自噬關(guān)鍵蛋白Beclin-1和LC3的表達(dá)，以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的GFP-LC

10、3檢測自噬。最后用RNAi沉默自噬關(guān)鍵基因Atg5的表達(dá)抑制自噬，再用MG-132和bortezomib干預(yù)三種肝癌細(xì)胞系后檢測凋亡，更直接地明確自噬通路在其中所發(fā)揮的作用。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白酶體抑制劑MG-132和bortezomib對三種肝癌細(xì)胞系MHCC-97H，PLC/PRF/5和Huh-7都有一定的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，量效曲線呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。其中Huh-7最敏感，在一定濃度作用下，達(dá)到半數(shù)致死量需

11、36h，而MHCC-97H最抵抗，半數(shù)致死量需60h，PLC/PRF/5居中，需48h。同時(shí)MG-132和bortezomib都可以在三種肝癌細(xì)胞系中激活自噬。當(dāng)用兩種自噬抑制劑CQ或3-MA抑制自噬通路后，MG-132或bortezomib在三種肝癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞都顯著增多(P<0.05)。最后用RNAi沉默自噬關(guān)鍵基因Atg5的表達(dá)抑制自噬活性后，再用MG-132和bortezomib干預(yù)，凋亡的細(xì)胞仍增多(P<0.05)。

12、
　　 體外研究初步表明，將泛素蛋白酶體通路作為干預(yù)靶點(diǎn)有望成為治療肝癌新的方法。同時(shí)蛋白酶體抑制劑的使用將激活自噬溶酶體通路，后者作為代償機(jī)制發(fā)揮保護(hù)腫瘤細(xì)胞的作用。通過調(diào)控(抑制)自噬通路活性可增強(qiáng)蛋白酶體抑制劑對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
　　 第二部分、自噬溶酶體通路在硼替佐米抗肝癌中的體內(nèi)研究
　　 蛋白酶體抑制劑硼替佐米(bortezomib)已被美國FDA批準(zhǔn)用于血液系統(tǒng)多發(fā)性骨髓瘤和套狀淋巴瘤的臨床治療

13、。然而，蛋白酶體抑制劑在眾多實(shí)體瘤(如胃癌，胰腺癌等)中的臨床前期研究卻發(fā)現(xiàn)效果不佳。在前一部分我們已初步證實(shí)了bortezomib在體外對肝癌有確切的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的效果，同時(shí)自噬溶酶體通路被激活發(fā)揮保護(hù)腫瘤細(xì)胞的作用?？紤]自噬激活可能是實(shí)體瘤對bortezomib抵抗的原因之一，因此我們將針對上述兩條蛋白降解通路，在體內(nèi)進(jìn)一步研究。
　　 選用在體外較抵抗的MHCC-97H和體外較敏感的Huh-7兩種肝癌細(xì)胞系，按常規(guī)建

14、立MHCC-97H裸鼠原位肝癌模型和Huh-7皮下肝癌模型。兩種模型每種24只均隨機(jī)分為四組，術(shù)后第三天經(jīng)腹腔注射分別給予saline，CO，bortezomib，CQ聯(lián)合bortezomib。第35天處死裸鼠，計(jì)算每組腫瘤平均體積。兩種模型各組再行免疫組化技術(shù)：Tunel染色檢測凋亡，Ki-67染色檢測增殖，P62染色檢測自噬。同時(shí)各組制作電鏡切片，進(jìn)一步明確凋亡和自噬情況。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，35天后在體外敏感的Huh-7皮下

15、瘤，bortezomib組的平均腫瘤體積與對照組相比，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.85)；而在體外相對抵抗的MHCC-97H原位瘤，bortezomib組平均腫瘤體積與對照組相比顯著減小(P<0.05)。當(dāng)聯(lián)合CQ抑制自噬后，兩種模型平均腫瘤體積均較單用bortezomib顯著減小(P<0.05)。Tunel染色發(fā)現(xiàn)，單用bortezomib在MHCC-97H原位瘤和Huh-7皮下瘤都顯著誘導(dǎo)凋亡，與對照組相比均有顯著性差異(P<0.05

16、)。Ki-67染色提示bortezomib使MHCC-97H的增殖指數(shù)顯著下降(P<0.05)，而對Huh-7皮下瘤未見明顯的抗增殖效果，當(dāng)聯(lián)合CQ后較單用bortezomib誘導(dǎo)凋亡和抗增殖效果均更顯著(P<0.05)。P62染色提示在兩種肝癌模型體內(nèi)，bortezomib均可在一定程度上激活自噬，而CQ可以抑制這種效應(yīng)。透射電鏡更提供了bortezomib在兩種肝癌模型中誘導(dǎo)凋亡，激活自噬以及CQ抑制自噬的直接證據(jù)。
　　

17、體內(nèi)研究結(jié)果表明蛋白酶體抑制劑bortezomib能夠抑制MHCC-97H裸鼠肝臟原位成瘤，卻無法抑制Huh-7裸鼠皮下成瘤。結(jié)合其他研究結(jié)果，我們認(rèn)為原因可能在于MHCC-97H原位瘤比Huh-7皮下瘤有更豐富的血供，繼而導(dǎo)致差異性的腫瘤血液灌注和藥物暴露。因此，我們認(rèn)為蛋白酶體抑制劑bortezomib具有一定的抗肝癌作用，而采用經(jīng)肝動(dòng)脈插管化療的方式有望達(dá)到其在肝癌治療中的最佳療效。此外，本項(xiàng)研究證實(shí)在體內(nèi)自噬溶酶體通路同樣被激活

18、而發(fā)揮保護(hù)性作用，而應(yīng)用自噬抑制劑CQ能夠增強(qiáng)bortezomib的體內(nèi)抗肝癌效果。
　　 第三部分、自噬溶酶體通路在奧沙利鉑抗肝癌中的體內(nèi)外研究
　　 在肝癌的臨床治療中，對于尚無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移但又不能一期切除的大肝癌常使用化療藥物經(jīng)肝動(dòng)脈插管灌注的方式令其轉(zhuǎn)變?yōu)榭汕谐男「伟?，再行手術(shù)。但仍有相當(dāng)部分患者并不能達(dá)到預(yù)期的腫瘤縮減效果。我們在體外和體內(nèi)業(yè)已證實(shí)在蛋白酶體抑制劑抗肝癌中，自噬溶酶體通路被激活而發(fā)揮保護(hù)性作用，那

19、么在其他肝癌的常規(guī)化療中，可能也存在同樣的規(guī)律。同時(shí)，自噬保護(hù)腫瘤細(xì)胞免于凋亡的可能機(jī)制值得探索。而對于曾行肝動(dòng)脈插管化療的臨床肝癌患者，其腫瘤組織中自噬活性是否確實(shí)升高，我們將繼續(xù)研究以明確。
　　 選用常規(guī)化療藥物奧沙利鉑(oxaliplatin)，兩種自噬抑制劑3-methyladenine(3-MA)和chloroquine(CQ)，抗氧化劑N-acetyl-cysteine(NAC)。選用兩種肝癌細(xì)胞系：SMMC-77

20、21和Huh-7。用Western blot檢測自噬關(guān)鍵蛋白LC3的表達(dá)，以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的GFP-LC3，透射電鏡檢測自噬；Annexin-V-FITC和propidiumiodide(PI)雙染，流式細(xì)胞儀檢測凋亡。2’，7’-dichloro-fluorescein diacetate染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平。建立Huh-7裸鼠皮下肝癌模型，隨機(jī)分為四組，術(shù)后第三

21、天經(jīng)腹腔注射分別給予saline，CQ，oxaliplatin，CQ聯(lián)合oxaliplatin，第35天處死裸鼠，計(jì)算每組腫瘤平均體積。各組取瘤組織免疫組化LC3染色檢測自噬，Tunel染色檢測凋亡。取40例石蠟包埋的臨床肝癌組織標(biāo)本(20例曾行局部化療，20例未行)，另加10例正常肝組織，免疫組化LC3染色檢測分析各組自噬活性。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)和體外，oxaliplatin在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的同時(shí)也激活自噬溶酶體通路，

22、且自噬同樣發(fā)揮保護(hù)性作用。而在抑制自噬通路的同時(shí)予抗氧化劑NAC，凋亡細(xì)胞數(shù)量減少，提示抑制自噬后凋亡增加可能與細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高有關(guān)。LC3免疫組化分析亦提示曾行局部化療的肝癌組織較未行組自噬活性顯著升高(P=0.002)。
　　 本部分研究進(jìn)一步表明，在肝癌接受化療藥物治療時(shí)，自噬溶酶體通路被激活且發(fā)揮保護(hù)性作用具有一定的普遍性，可通過調(diào)控自噬通路以增加化療效果。抑制自噬后細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚積、線粒體功能障礙進(jìn)而導(dǎo)致ROS水平

23、增加可能是凋亡增加的機(jī)制。曾行局部化療的肝癌組織自噬活性升高，提示臨床用藥使腫瘤縮減效果不佳可能與激活的自噬保護(hù)作用相關(guān)，化療藥物與自噬抑制劑CQ聯(lián)用值得行進(jìn)一步臨床試驗(yàn)。
　　 結(jié)論：
　　 1.將泛素蛋白酶體通路作為干預(yù)靶點(diǎn)有望成為治療肝癌新的方法，自噬溶酶體通路是與其功能代償互補(bǔ)的系統(tǒng)，通過調(diào)控(抑制)自噬通路活性可增強(qiáng)蛋白酶體抑制劑對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
　　 2.蛋白酶體抑制劑硼替佐米(bortezom

24、ib)在實(shí)體瘤中的作用不應(yīng)僅局限于用作其他化療藥物的輔助制劑，其抗腫瘤效果依賴于較好的腫瘤血液灌注和有效藥物暴露。因此bortezomib具有一定的抗肝癌作用，采用經(jīng)肝動(dòng)脈插管化療的方式有望達(dá)到其在肝癌治療中的最佳療效。
　　 3.在肝癌接受化療藥物治療時(shí)，自噬溶酶體通路被激活且發(fā)揮保護(hù)性作用具有一定的普遍性，可通過調(diào)控自噬通路以增加化療效果。抑制自噬后細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚積、線粒體功能障礙進(jìn)而導(dǎo)致活性氧簇(ROS)水平升高可能是凋亡

25、增加的機(jī)制。
　　 創(chuàng)新點(diǎn)：
　　 1.首次在肝癌細(xì)胞系內(nèi)探索將泛素蛋白酶體通路作為干預(yù)靶點(diǎn)治療肝癌的可行性，并在肝癌裸鼠模型水平探索了蛋白酶體抑制劑硼替佐米在肝癌中的適用性，初步明確了其在實(shí)體瘤中的應(yīng)用條件，拓寬了其應(yīng)用范圍。
　　 2.首次從肝癌細(xì)胞系、肝癌裸鼠模型和肝癌臨床組織樣本三個(gè)水平，明確了在接受化療中自噬溶酶體通路被激活并發(fā)揮保護(hù)性作用的現(xiàn)象和機(jī)制，為臨床聯(lián)合用藥提供理論基礎(chǔ)。
　　 潛在應(yīng)