miR-138-5p 在胃癌順鉑耐藥中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　胃癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，我國是胃癌高發(fā)國家。雖然近年來胃癌的診療技術(shù)已經(jīng)取得了一些進(jìn)步，但由于腫瘤早期癥狀表現(xiàn)無特異性，及高侵襲性和轉(zhuǎn)移率，使得胃癌總體預(yù)后欠佳。晚期胃癌治療以姑息性化療為主，鉑類作為胃癌化療的基石類藥物，大部分含鉑方案的有效率均不超過50%，存在鉑類原發(fā)或繼發(fā)耐藥現(xiàn)象限制了其在臨床應(yīng)用。近年來研究發(fā)現(xiàn)microRNAs（miRNAs）的表達(dá)異常與腫瘤化療敏感性密切相關(guān)。miR-138-

2、5p在肺癌化療耐藥中的作用已經(jīng)得以證實(shí)，可通過負(fù)性調(diào)控 ERCC1表達(dá)影響 DNA損傷修復(fù)能力減少順鉑耐藥。但迄今為止，關(guān)于miR-138-5p是否能調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞化療耐藥及其機(jī)制尚未明確，是否能真正用于指導(dǎo)胃癌患者臨床治療亦未明確。因此，本課題擬探討 miR-138-5p能否調(diào)控胃癌細(xì)胞株（SGC7901）對(duì)順鉑治療敏感性，及其可能的作用機(jī)制。并進(jìn)一步探討晚期胃癌患者癌組織中及血漿中miR-138-5p的表達(dá)水平及其與一線含鉑方案化療療

3、效的相關(guān)性。以期更好的指導(dǎo)晚期胃癌患者臨床個(gè)體化治療。
　　本研究在前期的臨床病例資料收集過程中發(fā)現(xiàn)晚期胃癌伴有低鈉血癥患者預(yù)后明顯變差，提示低鈉血癥為胃癌負(fù)性療效預(yù)測(cè)因子。而目前關(guān)注晚期胃癌與低鈉血癥關(guān)系的研究較少,因此本研究探討了晚期胃癌患者合并低鈉血癥發(fā)生情況對(duì)其一線治療療效、預(yù)后的影響，并進(jìn)一步探討低鈉血癥影響晚期胃癌患者化療療效及預(yù)后的原因，是否與 miR-138-5p表達(dá)相關(guān)。以期將患者的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)與miRNA檢測(cè)結(jié)果

4、相結(jié)合更好的指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療。
　　本研究共分三部分。
　　第一部分：miR-138-5p在胃癌順鉑耐藥細(xì)胞中的作用及機(jī)制研究
　　目的：研究miR-138-5p在胃癌順鉑耐藥細(xì)胞中表達(dá)情況及其介導(dǎo)順鉑耐藥的可能機(jī)制。
　　方法：采用基因芯片技術(shù)分析胃癌耐順鉑細(xì)胞 SGC7901/DDP和親本細(xì)胞SGC7901中表達(dá)差異 miRNAs。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè) miR-138-5p作用靶點(diǎn)。采用qRT-PCR及 We

5、stern blot分別檢測(cè)胃癌耐順鉑細(xì)胞 SGC7901/DDP和親本細(xì)胞SGC7901中miR-138-5p及ERCC1、ERCC4的表達(dá)水平；利用包含干擾miR-138-5p表達(dá)的目的基因的慢病毒液及陰性對(duì)照 negative control RNA（NC)轉(zhuǎn)染至SGC7901細(xì)胞下調(diào)miR-138-5p表達(dá)，轉(zhuǎn)染至SGC7901/DDP細(xì)胞上調(diào)miR-138-5p表達(dá)；熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果，qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后miR-

6、138-5p表達(dá)；Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后ERCC1，ERCC4的表達(dá)情況；MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑治療的敏感性；
　　結(jié)果：1.基因芯片檢測(cè)結(jié)果表明 miR-138-5p在SGC7901/DDP細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)是SGC7901中的0.2686倍。進(jìn)一步采用qRT-PCR方法驗(yàn)證miR-138-5p在SGC7901中的表達(dá)量是SGC7901/DDP的5.006倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。兩者結(jié)果一致，表明其在胃癌耐藥

7、細(xì)胞株（SGC7901/DDP）中表達(dá)明顯下調(diào)；2.生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-138-5p作用靶點(diǎn)為核苷酸切除修復(fù)通路中的ERCC1、ERCC4蛋白。Western blot結(jié)果表明ERCC1和ERCC4在SGC7901/DDP中表達(dá)較SGC7901細(xì)胞中明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；3.轉(zhuǎn)染攜帶目的基因片段慢病毒液調(diào)節(jié)miR-138-5p的表達(dá)，在SGC7901細(xì)胞中下調(diào)miR-138-5p的表達(dá)，在SGC7901/DD

8、P細(xì)胞中上調(diào)miR-138-5p的表達(dá)。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞呈現(xiàn)紅色為表達(dá)下調(diào)，SGC7901/DDP細(xì)胞呈現(xiàn)綠色為表達(dá)上調(diào)。采用qRT-PCR方法檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染后 miR-138-5p表達(dá)水平，結(jié)果證實(shí)其在 SGC7901-LV-miR-138-5p-KD組中的表達(dá)下調(diào)，分別是SGC7901和NC-KD組的0.209倍和0.211倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在 SGC7901/DDP-LV-miR138-

9、5p-OE中表達(dá)上調(diào)，分別是SGC-7901/DDP和SGC7901/DDP-LV-NC-OE組4.17和4.36倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；4. Western blot結(jié)果表明ERCC1、ERCC4在SGC7901-LV-miR138-5p-KD（miR-138-5p表達(dá)下調(diào)細(xì)胞）內(nèi)的表達(dá)明顯升高，在SGC7901/DDP-LV-miR138-5p-OE（miR-138-5p表達(dá)上調(diào)細(xì)胞）內(nèi)的表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

10、（P＜0.01）；5.MTT法結(jié)果表明SGC7901/DDP-LV-miR138-5p-OE組細(xì)胞，miR-138-5p表達(dá)上調(diào)后對(duì)順鉑的敏感性較 SGC7901/DDP和SGC7901/DDP-LV-NC-OE增加，IC50分別是：3.14±0.32、6.81±0.12、6.89±0.14，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。SGC7901-LV-miR138-5p-KD組細(xì)胞，miR-138-5p表達(dá)下調(diào)后對(duì)順鉑的耐藥性增強(qiáng)，其 IC

11、50較 SGC7901和SGC7901-LV-NC-KD細(xì)胞升高，IC50分別為：0.39±0.04、0.20±0.01、0.25±0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　結(jié)論：miR-138-5p在胃癌耐藥細(xì)胞株（SGC7901/DDP）中低表達(dá)，通過慢病毒轉(zhuǎn)染使得miR-138-5p表達(dá)上調(diào)后，SGC7901/DDP細(xì)胞中ERCC1、ERCC4表達(dá)明顯減少，核苷酸切除修復(fù)缺陷，增強(qiáng)胃癌耐藥細(xì)胞株 SGC7901/DDP

12、對(duì)順鉑治療的敏感性，起化療增敏作用。下調(diào)miR-138-5p表達(dá)，SSGC7901細(xì)胞中ERCC1、ERCC4表達(dá)明顯增加，核苷酸切除修復(fù)增加，導(dǎo)致胃癌細(xì)胞株 SGC7901對(duì)順鉑耐藥。推測(cè)其可能的作用機(jī)制為通過負(fù)性調(diào)控ERCC1、ERCC4表達(dá)干擾DNA損傷修復(fù)調(diào)節(jié)對(duì)順鉑治療的敏感性。
　　第二部分：miR-138-5p表達(dá)水平與晚期胃癌含鉑方案化療療效的相關(guān)性研究
　　目的：探討晚期胃癌患者癌組織中及血漿中miR-138

13、-5p的表達(dá)水平與一線含鉑方案化療療效的相關(guān)性。
　　方法：采用qRT-PCR方法檢測(cè)51例晚期胃癌患者癌組織及血漿中miR-138-5p的表達(dá)水平，同時(shí)選取相匹配的癌旁組織標(biāo)本20例及健康志愿者血漿20例作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。所有患者均接受含鉑方案一線化療，并評(píng)價(jià)其近期療效及一線化療后無進(jìn)展生存時(shí)間、總生存。
　　結(jié)果：胃癌組織中miR-138-5p的表達(dá)水平低于癌旁組織（t=4.30，P﹤0.01），胃癌患者血漿中 miR-13

14、8-5p的表達(dá)水平低于健康對(duì)照組（t=3.04，P﹤0.01）。晚期胃癌患者癌組織中及血漿中miR-138-5p的表達(dá)水平與患者性別、年齡、轉(zhuǎn)移部位、轉(zhuǎn)移器官數(shù)目、ECOG評(píng)分、癌組織分化程度等均無相關(guān)性（P>0.05）。51例患者均可評(píng)價(jià)近期療效，其中11例PR、23例SD、17例PD，ORR率為21.6%，DCR率為66.7%。癌組織及血漿中 miR-138-5p的相對(duì)表達(dá)量均與化療近期療效呈正相關(guān)(P﹤0.05)。采用 ROC曲線

15、判斷 miR-138-5p表達(dá)水平預(yù)測(cè)化療有效率的最佳截?cái)嘀?，取癌組織中miR-138-5p表達(dá)量0.104為截點(diǎn)，AUC值為0.907，預(yù)測(cè)含鉑方案化療后疾病控制的靈敏度為90.91%，特異度為75%。超過0.104為高表達(dá)組，低于0.104為低表達(dá)組。取血漿中miR-138-5p表達(dá)量0.091為截點(diǎn)，AUC值為0.973，預(yù)測(cè)含鉑方案化療后疾病控制的靈敏度為100%，特異度為85%。超過0.091為高表達(dá)組，低于0.091為低表達(dá)

16、組。51例患者中位 PFS時(shí)間為4.0月（95%CI：3.7～4.3月），中位OS為9.9月（95%CI：9.2～10.6月）。胃癌組織中miR-138-5p高表達(dá)與低表達(dá)組的中位PFS分別為5.5月（95%CI：3.5～7.5月）及3.2月（95%CI：1.7～4.7月）（P<0.05）；中位OS分別為11.2月（95%CI：10.9～11.5月）及9.2月（95%CI：8.7～9.7月），采用Log-rank檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

17、（P<0.01）。血漿中miR-138-5p高表達(dá)與低表達(dá)組的中位PFS分別為5.5月（95%CI：3.0～8.1月）及3.5月（95%CI：1.5～5.5月）（P<0.05）。中位OS分別為11.4月（95%CI：11.0～11.8月）及9.5月（95% CI:8.6～10.4月），采用Log-rank檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。線性相關(guān)分析表明，胃癌腫瘤組織與血漿中miR-138-5p的表達(dá)具有正相關(guān)性(r=0.899

18、，P＜0.05)。
　　結(jié)論：胃癌組織及血漿中miR-138-5p的表達(dá)水平具有正相關(guān)性，且癌組織及血漿中miR-138-5p表達(dá)水平高低與晚期胃癌患者一線含鉑化療方案的近期療效、一線PFS、OS具有一定的正相關(guān)性。
　　第三部分：低鈉血癥與晚期胃癌化療療效及miR-138-5p表達(dá)水平的相關(guān)性研究
　　目的：探討晚期胃癌合并低鈉血癥患者的臨床特點(diǎn)及預(yù)后分析，及低鈉血癥發(fā)生與miR-138-5p表達(dá)水平的相關(guān)性；

19、>　　方法：收集2009/06/01-2015/12/31期間在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的胃癌合并低鈉血癥患者信息，從中篩選出44例晚期胃癌伴有低鈉血癥并接受一線化療患者，并將45例晚期胃癌血鈉正常患者作為對(duì)照組，進(jìn)行回顧性對(duì)照分析。收集這些患者一線化療的近期療效，一線 PFS及毒副反應(yīng)信息。采用 qRT-PCR方法檢測(cè)了低鈉組共5例、對(duì)照組共10例患者組織中miR-138-5p表達(dá)水平。
　　結(jié)果：晚期、女性、肝臟及腹膜轉(zhuǎn)移

20、、ECOG評(píng)分低的胃癌患者更易合并低鈉血癥。低鈉組及對(duì)照組一線化療的 ORR率分別為：25%(11/44)和40.0%(18/45)（P=0.131）；DCR率分別為40.9%(18/44)和73.3%(33/45)(P=0.002)，疾病控制率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低鈉組一線化療中位 PFS為3.0個(gè)月（95%CI：2.8～3.7月），對(duì)照組一線化療中位PFS為4.5個(gè)月（95%CI：4.3～6.2月），(χ2=14.618, P<0