多西環(huán)素對(duì)肺癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的與意義： 隨著對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）認(rèn)識(shí)的深入，MMPs在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用越來(lái)越引起人們的重視。目前, 應(yīng)用MMPs抑制劑治療腫瘤已成為腫瘤研究的新方向。多西環(huán)素（DOX，一種半合成四環(huán)素族抗生素）是MMPs 抑制劑的一種，因其毒性小、半衰期長(zhǎng)而研究較為廣泛。 本課題通過(guò)研究DOX對(duì)肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移特性的影響及相關(guān)機(jī)制的研究，為肺癌的治療提供一個(gè)新的方法與手段。 方法：

2、 應(yīng)用MTT比色法觀察DOX 對(duì)A549細(xì)胞體外增殖的影響；應(yīng)用透射電鏡、熒光顯微鏡、DNA瓊脂糖凝膠電泳、流式細(xì)胞儀研究DOX 對(duì)A549細(xì)胞的促凋亡作用；通過(guò)細(xì)胞體外粘附試驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)、侵襲試驗(yàn)、裸鼠人工肺轉(zhuǎn)移模型等的方法研究DOX 對(duì)A549細(xì)胞的粘附、侵襲和移動(dòng)力可能存在的作用；通過(guò)明膠底物SDS－PAGE凝膠電泳、RT-PCR、Western Blot觀察DOX 對(duì)明膠酶活性、表達(dá)的影響；應(yīng)用免疫組化的方法觀察DOX 對(duì)A

3、549細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響。并應(yīng)用RT-PCR、Western Blot觀察DOX 對(duì)c-fos, c-junmRNA及蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1. 5 mg/L以上的DOX可以抑制A549細(xì)胞增殖(P < 0.01)，該抑制作用呈時(shí)間劑量依賴(lài)效應(yīng)。而2.5mg/L的DOX 作用不著(P > 0.05)。 2. 20、40mg/L的DOX作用48h后，電鏡及熒光顯微鏡顯示：A549細(xì)胞出現(xiàn)體積縮小，染色質(zhì)

4、邊集，凋亡小體形成等細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；DNA瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)典型的梯狀條帶，DOX劑量越大，條帶越明顯；AnnexinV-PI雙染顯示：0、10、20、40mg/L DOX作用后，細(xì)胞凋亡率分別為2．22％、5．86％、12．6％、20．59％。 3. 2.5、5、10mg/L的DOX作用48h后，其粘附率分別為81.6％、67.2％、55.3％，而對(duì)照組為96％。作用24h后，2.5、5、10mg/L的DOX對(duì)A549細(xì)胞在M

5、atrigel上的移動(dòng)抑制率分別為3.7％、10.8％、18.2％；作用48h后，其移動(dòng)抑制率分別為5.8％、20.2％、35.8％；5、10mg/L的DOX可以抑制A549細(xì)胞在Matrigel上侵襲，其侵襲抑制率分別為12％、33％，而2.5 mg/L DOX對(duì)其無(wú)明顯影響（P>0.05）。應(yīng)用30mg/kg/dDOX處理的裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)顯著低于對(duì)照組。DOX組和對(duì)照組裸鼠肺表面轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)分別為74±19個(gè)和15±35個(gè)，其轉(zhuǎn)

6、移抑制率達(dá)79％。 4. 2.5、5、10mg/L的DOX均可不同程度的抑制A549細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）的活性，在10mg/L時(shí)尤為顯著。10mg/L的DOX可抑制A549細(xì)胞MMP2的mRNA合成及蛋白表達(dá)。 5．10mg/L的DOX體外可以抑制A549細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vacularendothelial growth factor, VEGF）的表達(dá)。應(yīng)用30mg/kg/dDOX處理的裸鼠肺轉(zhuǎn)移

7、瘤中VEGF的表達(dá)明顯低于對(duì)照組。 6．10mg/L的DOX可以抑制A549細(xì)胞c-jun mRNA及蛋白表達(dá)。 結(jié)論: 1．藥用劑量DOX可以抑制A549細(xì)胞體外增殖，大劑量可促其凋亡； 2．藥用劑量的DOX即可抑制A549細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)Matrigel的粘附、移動(dòng)及侵襲；安全劑量DOX可減少裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)形成； 3．藥用劑量的DOX可以抑制A549細(xì)胞MMP2的活性、表達(dá)；DOX抑制A