MDIG對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制及其在肺癌中的作用的研究.pdf

1、背景與目的：
　　肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是最主要的癌癥致死病因。2012年，美國(guó)預(yù)期肺癌新增病例226，160例，占全部預(yù)期癌癥新增病例的13.8％;預(yù)期肺癌死亡病例160，340例，占全部預(yù)期癌癥死亡病例的27.78％。目前肺癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。
　　MDIG(Mineral dust-induced gene)，即礦物粉塵誘導(dǎo)基因，2005年首先在礦工的肺泡巨噬細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，并被證實(shí)是一種肺癌相關(guān)基因。隨后

2、的研究表明，該基因與Tsuneoka等人發(fā)現(xiàn)的MINA53(Myc-induced nuclear antigen with amolecular mass of53kDa)是同源基因。MDIG在肺癌細(xì)胞株及肺癌組織中表達(dá)，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，且在部分肺癌患者中其表達(dá)水平高于癌旁正常肺組織。隨后，向人肺腺癌細(xì)胞株A549中轉(zhuǎn)染靶向MDIG小干擾RNA（mdig siRNA）后發(fā)現(xiàn):細(xì)胞由DNA合成前期（G1期）向DNA合成期（S期）

3、的轉(zhuǎn)換延遲，說(shuō)明MDIG對(duì)細(xì)胞周期有調(diào)節(jié)作用。
　　由G1期向S期轉(zhuǎn)換是細(xì)胞周期進(jìn)程中的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)。p27KIP1是一種CKI，在細(xì)胞周期中通過(guò)抑制cyclin D和CDK4/6形成的復(fù)合物及cyclin E和CDK2形成的復(fù)合物而抑制細(xì)胞由G1期向S轉(zhuǎn)換，是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的重要因子。
　　細(xì)胞周期調(diào)控失常導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，可能是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一。研究表明，在肺癌中，許多調(diào)控G1/S期轉(zhuǎn)換的基因異常表達(dá)。向鼠胚胎

4、成纖維細(xì)胞株NIH/3T3中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDIG質(zhì)粒后，通過(guò)基因芯片比較轉(zhuǎn)染MDIG質(zhì)粒細(xì)胞株及對(duì)照質(zhì)粒細(xì)胞株的cDNA的差異，發(fā)現(xiàn):細(xì)胞周期基因在兩組細(xì)胞中有表達(dá)差異。然而，MDIG是如何調(diào)節(jié)細(xì)胞周期基因，二者的相互作用在肺癌發(fā)病機(jī)制中的意義尚不清楚。
　　我們推測(cè)，MDIG可能通過(guò)影響細(xì)胞周期基因參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。因此，本文將A549細(xì)胞株作為靶細(xì)胞株來(lái)研究MDIG基因?qū)?xì)胞周期及細(xì)胞周期基因的影響，以期望闡述MDIG基因調(diào)控G

5、1/S期轉(zhuǎn)換的機(jī)制;在此基礎(chǔ)上，在手術(shù)切除的肺癌組織及癌旁正常肺組織中研究MDIG與細(xì)胞周期基因表達(dá)，以探討二者在肺癌發(fā)病機(jī)制中的臨床意義。
　　材料與方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞用含10％熱滅活新鮮胎牛血清的RPMI1640的培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)。
　　2、標(biāo)本來(lái)源
　　收集自2009年4月至2009年12月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科行手術(shù)治療的原發(fā)性

6、肺癌患者的肺癌組織和癌旁正常肺組織標(biāo)本共25對(duì)。全部患者在手術(shù)前未接受放射治療及化學(xué)藥物治療;在手術(shù)后經(jīng)病理檢查證實(shí)為肺癌，其中:鱗癌10例、腺癌9例、小細(xì)胞癌4例及腺鱗癌2例;保存有完整的病例及預(yù)后資料。肺癌標(biāo)本取自腫瘤中心且無(wú)壞死的部位，并經(jīng)病理證實(shí)為癌組織;癌旁正常肺組織取自距離腫瘤可視邊界5cm以上的經(jīng)病理證實(shí)為非炎癥、非淤血、非氣腫的正常肺組織。組織標(biāo)本在離體后5分鐘內(nèi)取材、置于液氮中5分鐘后，置于-80℃保存，進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫

7、印跡(WB)分析;同時(shí)取部分肺癌組織經(jīng)4％多聚甲醛固定，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(IHC)分析，以確定MDIG及p27KIP1的細(xì)胞內(nèi)定位。
　　3、siRNA干擾
　　設(shè)計(jì)并合成靶向MDIG基因的siRNA（mdig siRNA）及陰性對(duì)照siRNA（scramble siRNA）。共分為5組，分別為:空白組、只加轉(zhuǎn)染試劑組（mock組）、陰性對(duì)照siRNA組（scramble siRNA組）、mdig siRNA1組及mdi

8、g siRNA2組。采用Lipofectamine2000將siRNA轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)及72小時(shí)，分別使用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）和WB檢測(cè)干擾效率。
　　4、逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)
　　采用TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，NanoDrop1000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，通過(guò)OD260/280比值判定RNA質(zhì)量。采用PrimeScript(@)RT reage

9、nt Kit With gDNAEraser(Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用SYBR(@) Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)試劑盒分別擴(kuò)增MDIG、p18INK4c、p19INK4d、p21 WAF/CIP1、p27KIP1、p57KIP2、cyclin D1及cyclin E1。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對(duì)定量分析。
　　5、蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)檢測(cè)
　　

10、提取細(xì)胞或組織中的總蛋白;BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度;將80μg總蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜;抗MDIG抗體、抗ACTIN抗體、抗p27KIP1抗體、抗第10位絲氨酸磷酸化p27KIP1蛋白（p-p27KIP1（Ser10））抗體或抗第187位蘇氨酸磷酸化p27KIP1蛋白(p-p27KIP1(Thr187))抗體4℃孵育過(guò)夜;相應(yīng)二抗室溫孵育2小時(shí)后化學(xué)發(fā)光法顯色;UVP成像系統(tǒng)成像;Gel-Pro4.0圖像分析軟

11、件分析灰度值。
　　6、四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖
　　將單個(gè)細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，進(jìn)行siRNA干擾實(shí)驗(yàn)后，每孔加入20μlMTT溶液(5mg/ml)，培養(yǎng)4小時(shí)，每孔加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔490nm波長(zhǎng)的吸光值。
　　結(jié)果：
　　1、在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mdig siRNA可抑制細(xì)胞增殖、使細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換延遲。
　　A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mdig s

12、iRNA使細(xì)胞內(nèi)MDIG mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)80％以上。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖明顯下降，細(xì)胞由G1期向S轉(zhuǎn)換延遲。
　　2、在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mdig siRNA對(duì)細(xì)胞周期基因p18 INK4c、p19INK4d、p21 WAF/CIP1、p27KIP1、p57KIP2、cyclinD1及cyclinE1 mRNA水平的影響。
　　在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mdig siRNA后，發(fā)現(xiàn)INK4蛋白家族成員p18IN

13、K4c、p19INK4dmRNA水平輕度下調(diào)，而CIP/KIP蛋白家族成員p21WAF/CIP1、p27KIP1、p57KIP2mRNA水平均上調(diào)，其中，p27KIP1mRNA水平明顯提高，其下游基因cyclinE1mRNA水平也輕度下調(diào)，而cyclinD1 mRNA水平在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)略有下降，但在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)則明顯上升。
　　3、在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mdig siRNA對(duì)p27KIP1蛋白水平的影響。在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染md

14、ig siRNA72小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)p27KIP1蛋白水平上調(diào)，p-p27KIP1(Ser10)蛋白水平隨著總p27KIP1蛋白水平提高而提高，但p-p27KIP1(Thr187)蛋白水平無(wú)明顯變化，提示:MDIG siRNA可能通過(guò)抑制p27 KIP1蛋白上第187位蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)的蛋白質(zhì)磷酸化而抑制p-p27KIP1蛋白的降解。
　　4、MDIG蛋白在肺癌組織及癌旁正常肺組織中表達(dá)情況。
　　在25例接受手術(shù)治療的肺癌患者

15、中，肺癌組織及癌旁正常肺組織中MDIG蛋白平均表達(dá)量之比為:2.14∶1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。其中，在肺鱗癌、腺癌、小細(xì)胞癌及腺鱗癌組織中MDIG蛋白的表達(dá)量明顯高于癌旁正常肺組織中該蛋白的表達(dá)量(p＜0.05)。
　　5、p27KIP1蛋白在肺癌組織及癌旁正常肺組織中表達(dá)情況。
　　在全部肺癌患者中，肺癌組織及癌旁正常肺組織中p27KIP1蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異(p＞0.05)。在各種類型的肺癌組織及癌旁肺組織

16、中p27KIP1蛋白表達(dá)量均無(wú)明顯差異。
　　6、在肺癌患者體內(nèi)，MDIG蛋白與p27KIP1蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析。
　　在全部25例肺癌組織中，MDIG蛋白與p27KIP1蛋白表達(dá)量無(wú)明顯相關(guān)性。但在9例患者的癌組織中可觀察到MDIG蛋白表達(dá)上調(diào)并伴有p27KIP1蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染靶向MDIG基因siRNA可抑制細(xì)胞增殖，使細(xì)胞阻滯在G1期，表明mdig的促細(xì)胞增殖作用主要作

17、用在細(xì)胞周期的G1期。
　　mdig siRNA可上調(diào)p27KIP1的表達(dá)，并可抑制p27KIP1蛋白上的第187位蘇氨酸位點(diǎn)磷酸化，提示MDIG的促細(xì)胞增殖作用乃至致癌活性可能是通過(guò)促進(jìn)p27KIP1蛋白上的第187位蘇氨酸磷酸化而抑制p27KIP1的表達(dá)，從而影響細(xì)胞周期進(jìn)程。
　　各種類型的肺癌組織中MDIG蛋白表達(dá)量均明顯高于癌旁正常肺組織中的表達(dá)量。然而p27KIP1蛋白的表達(dá)量在癌組織和癌旁正常肺組織中無(wú)明顯差別