血管生成素對(duì)miR-141的調(diào)控作用及其在血管生成中的功能.pdf

1、血管生成貫穿了腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的全過(guò)程，抗血管生成已被公認(rèn)為是腫瘤治療的有效途徑。血管生成素（Angiogenin/RNase-5，ANG）是促血管生成的一個(gè)關(guān)鍵因子，在血管生成和腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，是抗血管生成治療的潛在靶標(biāo)，但目前對(duì)其作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)并不全面和深入。miRNA是一類(lèi)高度保守的非編碼小分子RNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)或蛋白質(zhì)翻譯而在很多生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。為此，本論文從miRNA的視角研究了AN

2、G促血管生成的分子機(jī)制，并初步探索了ANG調(diào)控miR-141表達(dá)的分子機(jī)制。
　　本課題組已經(jīng)利用miRNA芯片，篩選獲得了一批在臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中響應(yīng)ANG刺激的miRNAs。為進(jìn)一步篩選出血管生成相關(guān)miRNAs，本論文將ANG與另一個(gè)重要的促血管生成因子bFGF的芯片結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比分析，最終獲得了6個(gè)能夠共同響應(yīng)ANG和bFGF刺激的miRNAs，包括5個(gè)下調(diào)的miRNAs（miR-141、miR-299-3

3、p、miR-329、miR-541和miR-589*）和1個(gè)上調(diào)的miRNA(miR-381)。通過(guò)體外血管生成模型分析，確定了兩個(gè)血管生成相關(guān)miRNAs（miR-141和miR-381）。在此基礎(chǔ)上，本學(xué)位論文對(duì)miR-141進(jìn)行了深入研究。
　　在HUVEC中，外加或過(guò)表達(dá)ANG能夠下調(diào)miR-141的水平，而抑制ANG表達(dá)則能夠上調(diào)miR-141的表達(dá)，提示ANG能夠下調(diào)miR-141的表達(dá)水平。利用體外細(xì)胞水平和體內(nèi)動(dòng)物

4、水平的血管生成分析模型，發(fā)現(xiàn)miR-141不僅能夠抑制HUVEC的增殖、遷移以及管腔形成等能力，而且也能夠抑制動(dòng)物體內(nèi)的血管生成，說(shuō)明miR-141可以通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成相關(guān)功能而抑制血管生成。
　　為探索miR-141抑制血管生成的分子機(jī)制，本論文通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)以及進(jìn)一步的功能注釋、文獻(xiàn)檢索分析，篩選到6個(gè)與血管生成密切相關(guān)的候選靶基因（其中2個(gè)靶基因TGFB2和CXCL12β最近已被報(bào)道為miR-141的靶基因）。

5、通過(guò)RT-qPCR、western blot以及雙熒光素酶報(bào)告基因分析等實(shí)驗(yàn)手段，最終確定TGFB2、CXCL12β、GAB1、GATA6以及NRP1為miR-141的靶基因。體外管腔形成功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGFB2、CXCL12β和GAB1能夠部分回復(fù)miR-141抑制的血管生成效應(yīng);遺憾的是，由于GATA6和NRP1的全長(zhǎng)基因尚未獲得，我們目前并不能證明這兩個(gè)基因在miR-141抑制血管生成中的作用。
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

6、，ANG不僅能夠下調(diào)miR-141的表達(dá)，而且miR-141可以通過(guò)對(duì)下游TGFB2、CXCL12β和GAB1等靶基因的調(diào)控而抑制血管生成，提示ANG可以通過(guò)抑制miR-141進(jìn)而上調(diào)其下游靶基因從而促進(jìn)血管生成。
　　為闡明ANG下調(diào)miR-141表達(dá)的分子機(jī)制，我們?cè)谵D(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平分析了ANG對(duì)miR-141生物發(fā)生過(guò)程的影響。結(jié)果顯示，ANG不改變miR-141的初始轉(zhuǎn)錄本pri-miR-141和前體pre-miR-141

7、的水平，提示ANG應(yīng)該是作用于成熟miR-141，即可能是促進(jìn)降解?？紤]到ANG具有核糖核酸酶活性，我們利用體外生化實(shí)驗(yàn)分析了ANG對(duì)成熟miR-141的酶切作用。結(jié)果顯示，野生型ANG以?xún)?nèi)切酶的形式在體外直接降解成熟miR-141，但其酶活性突變體卻未能降解miR-141;體內(nèi)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)也顯示ANG的酶活性突變體不能下調(diào)miR-141的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了ANG對(duì)miR-141的下調(diào)作用是通過(guò)其內(nèi)切酶活性實(shí)現(xiàn)的。
　　綜