CCL7-CCR3通路在非小細胞肺癌骨轉移中的作用和機制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　肺癌目前是發(fā)病率第二高的惡性腫瘤，并且在男性和女性中其致死率目前都居第二位。截止到2014年，美國肺癌的患病人數已高達430，090人，且以每年224210人的速度在增長。我國近年來隨著人口的老齡化和環(huán)境污染的加重，肺癌的發(fā)病率也開始成倍增加，每年約有40萬人被確診患有肺癌，發(fā)病率高達61.4/10萬，成為世界上肺癌患者最多的國家。盡管診斷、手術和放化療技術在過去的十年里都得到了很大的提高，肺癌的轉移和死亡率

2、仍居高不下，其5年生存率僅有約15％。肺癌根據細胞來源的不同可分為小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC約占全部肺癌的87％。NSCLC又分為腺癌、鱗癌和大細胞肺癌，其中腺癌是最常見的肺癌類型。目前，大部分患者在發(fā)現肺癌時已進入腫瘤的中晚期，甚至喪失手術機會，而即使在早期發(fā)現肺癌并行手術切除，術后復發(fā)和轉移率也

3、高達約1/3。
　　腫瘤的轉移是腫瘤導致死亡的重要原因。肺癌最常發(fā)生的遠處轉移部位包括神經系統、骨、肝、呼吸系統和腎上腺等，其中骨是肺腺癌最常見的轉移部位，39％的肺腺癌患者會發(fā)生骨轉移。肺癌的骨轉移主要表現為融骨性骨質破壞，導致骨折、嚴重骨痛等，甚至導致癱瘓，嚴重影響患者生存質量和預后，我們的前期研究也發(fā)現NSCLC骨轉移患者3年生存率不足30％。腫瘤的骨轉移是一個復雜的過程，目前認為肺癌骨轉移的發(fā)生機制主要有以下幾個步驟:腫瘤

4、細胞發(fā)生上皮間質轉化(Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)并從原發(fā)灶脫落入血、腫瘤細胞隨血液移動到骨組織、腫瘤細胞通過與成骨細胞和破骨細胞的相互作用促發(fā)融骨性破壞和腫瘤增殖，最終形成骨轉移灶。
　　趨化因子配體(chemokine ligands)是一類小于100個氨基酸的小分子化學趨化因子，在腫瘤的生物學特性及腫瘤免疫方面發(fā)揮重要作用。根據其開始兩個半胱氨酸殘基的不同可分為CC、CX

5、C和XC三類。CCL7是CC趨化因子家族的一員，已被發(fā)現在乳腺癌、腎癌、胃癌、結直腸癌等多種腫瘤中高表達，并可促進腫瘤的增殖、遷移和侵襲等。同時，CCL7在免疫系統中也發(fā)揮重要作用，可調控單核細胞、T細胞、NK細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞。然而，CCL7在肺癌中的作用和機制仍不清楚。
　　研究方法:
　　首先，我們選取在長征醫(yī)院進行手術的NSCLC患者原發(fā)灶樣本和瘤旁肺組織樣本各93例和NSCLC骨轉移灶樣本49例，通過表

6、達譜芯片檢測NSCLC原發(fā)灶和骨轉移灶間的基因表達差異，并通過qRT-PCR和IHC染色檢測了CCL7在瘤旁肺組織、NSCLC原發(fā)灶、NSCLC骨轉移灶間的表達差異，通過統計IHC染色結果CCL7表達水平與NSCLC患者預后的相關性。
　　然后，我們用CCL7刺激NSCLC細胞系A549和PC9，并檢測了CCL7對NSCLC細胞增殖、遷移、侵襲、EMT及誘導破骨細胞分化的作用。
　　CCL7的受體主要包括CCR1、CCR2和

7、CCR3，我們進一步通過qRT-PCR和IHC染色檢測了CCR1、CCR2和CCR3在NSCLC原發(fā)灶和骨轉移灶間的表達差異，并通過CCR2抑制劑和CCR3抑制劑檢測了抑制CCR2和CCR3對CCL7在NSCLC細胞中作用的影響，進一步通過慢病毒轉染構建了CCR3抑制的A549-shCCR3穩(wěn)轉細胞株，并通過裸鼠左心室荷瘤檢測了體內抑制CCR3對A549細胞轉移灶形成能力的影響。
　　最后，我們通過數字基因表達譜測序檢測了CCL7

8、刺激A549細胞后基因表達的變化，通過GO分析和KEGG分析探索可能的下游通路，并通過qRT-PCR驗證了CCL7/CCR3通路對下游基因表達的調控作用。
　　研究結果:
　　我們發(fā)現CCL7在NSCLC骨轉移灶中相對NSCLC原發(fā)灶顯著高表達，并且CCL7高表達的NSCLC患者臨床預后較NSCLC低表達的患者明顯更差。通過CCL7因子刺激A549和PC9細胞后，發(fā)現CCL7可促進A549和PC9細胞的遷移和侵襲能力，但對細

9、胞增殖無明顯作用，且通過western blot實驗發(fā)現CCL7可促進A549和PC9細胞的EMT。通過CCL7因子刺激小鼠骨髓巨噬細胞(bone marrowmacrophage，BMM)細胞后，我們發(fā)現CCL7不能直接促進破骨細胞分化，但來源于CCL7刺激的A549細胞的條件培養(yǎng)基相對來源于對照組A549細胞的條件培養(yǎng)基能更為明顯的促進BMM細胞向破骨細胞的分化。
　　同時，我們發(fā)現在CCR1、CCR2和CCR3中，CCR2和

10、CCR3均在NSCLC骨轉移灶中相對原發(fā)灶高表達，并與NSCLC患者的總體預后和腫瘤進展相關，且CCL7可促進CCR3的表達。通過抑制劑分別抑制CCR2和CCR3后，我們發(fā)現抑制CCR3可抑制CCL7對A549和PC9細胞遷移、侵襲、EMT及誘導破骨細胞分化的調控作用，但抑制CCR2對CCL7在A549和PC9細胞中的作用無明顯影響。通過慢病毒轉移構建A549-shCCR3穩(wěn)轉細胞株后，對裸鼠進行左心室荷瘤，通過活體成像檢測發(fā)現在體內抑

11、制CCR3可顯著抑制A549細胞轉移灶的形成。
　　最后，我們通過數字基因表達譜測序和信息學分析發(fā)現CCL7可促進多個與腫瘤發(fā)展密切相關的基因表達，如IL1B、CYP1B1、FLCN等，并可能通過激活Ras通路發(fā)揮作用，并且通過qRT-PCR驗證了CCL7在A549和PC9細胞中對這些下游基因表達的促進作用，并發(fā)現抑制CCR3可部分抑制CCL7對下游基因表達的調控作用。
　　結論:
　　基于以上研究結果，我們認為CCL

12、7可能在NSCLC轉移特別是骨轉移過程中發(fā)揮重要作用，CCL7可通過誘導NSCLC細胞的EMT促進其遷移和侵襲能力，并可促進NSCLC細胞誘導的破骨細胞分化，且在NSCLC細胞中，CCL7主要通過激活CCR3發(fā)揮作用，而抑制CCR3可在體內明顯抑制NSCLC的轉移。且CCL7/CCR3通路可能通過激活Ras信號通路在NSCLC中發(fā)揮作用。這些研究結果表明CCL7/CCR3通路在NSCLC的骨轉移過程中可能發(fā)揮重要作用，并可能作為NSCL