RNF146在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其調(diào)節(jié)肺癌增殖侵襲機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，肺癌的發(fā)病率和死亡率已躍居各類惡性腫瘤的首位，而非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總數(shù)的75-80％。目前肺癌的治療效果及肺癌患者的長期生存率仍不盡人意。肺癌發(fā)展進(jìn)程中多種因子的激活、抑制、相互協(xié)同或拮抗均對肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。因此，尋找肺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程中的有用的生物學(xué)標(biāo)記物，揭示肺癌新的治療靶點(diǎn)是目前腫瘤分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。
　　E3泛素連接酶能夠調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，如細(xì)胞增

2、殖、細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡等。一些E3泛素連接酶及其相關(guān)的泛素網(wǎng)的失調(diào)通常與人類疾病有關(guān)，特別是腫瘤和神經(jīng)退行性疾病。E3泛素連接酶可以是癌基因，也可以是抑癌基因，主要取決于它們所降解的靶蛋白是抑癌蛋白還是促癌蛋白。許多含有RING-finger結(jié)構(gòu)域的蛋白都擁有泛素連接酶活性，其中有些參與了腫瘤的生成和轉(zhuǎn)移。
　　RNF146(RING finger protein146)基因定位于人類染色體6q22，33上。其蛋白含有WWE和

3、N末端RING finger結(jié)構(gòu)域，被鑒定是一種E3泛素連接酶。研究發(fā)現(xiàn)，RNF146通過與PAR結(jié)合而抑制Parthanators，具有神經(jīng)保護(hù)作用。RNF146還能夠促進(jìn)DNA修復(fù)，防止DNA損傷性藥物或γ射線誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。在細(xì)胞損傷之后，RNF146能轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，促進(jìn)參與DNA損傷修復(fù)的各種核蛋白的泛素化和降解。更重要的是，RNF146能夠作為PAR核糖基化調(diào)控下的E3泛素連接酶，調(diào)節(jié)tankyrase依賴的axin的降解，從而

4、正向調(diào)節(jié)Wnt信號通路。
　　Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與肺癌的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散、復(fù)發(fā)密切相關(guān)，是在肺癌細(xì)胞和已擴(kuò)散肺癌細(xì)胞中保持高活性的通路。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活后可增加肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖的能力。Wnt通路可以通過多種機(jī)制異常活化，其主要功能是抑制磷酸化調(diào)控下的β-catenin的蛋白水解。從APC/Axin/GSK-3β/β-catenin降解復(fù)合體中被釋放的β-catenin能夠進(jìn)入細(xì)胞核，激活Wnt的靶基因。在這一過程中Axin作為一

5、種構(gòu)架蛋白參與β-catenin降解復(fù)合體的形成，其穩(wěn)定性至關(guān)重要。Tankyrase(PARP5)能夠催化PAR轉(zhuǎn)移至Axin的殘基上，導(dǎo)致Axin的PAR核糖基化。RNF146能夠通過自身的PAR結(jié)合域與PAR核糖基化的Axin結(jié)合，然后發(fā)揮其E3連接酶的作用，降解Axin，從而引起β-catenin降解復(fù)合體的解散，胞質(zhì)內(nèi)β-catenin聚集，促進(jìn)Wnt信號通路。之前的研究已經(jīng)證明Axin與肺癌的侵襲和增殖能力密切相關(guān)，因此我們

6、推測，RNF146可能通過調(diào)節(jié)Axin的穩(wěn)定性而影響肺癌中β-catenin的表達(dá)與定位，從而對肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。
　　為了證實(shí)我們的推測，我們首先采用RT-PCR、Western-Blot和免疫組織化學(xué)方法檢測手術(shù)切除的肺癌和癌旁肺組織中RNF146的表達(dá)水平及其與臨床病理因素和肺癌預(yù)后的關(guān)系、并分析RNF146與Axin和β-catenin表達(dá)的相關(guān)性。然后在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染RNF146過表達(dá)或者干

7、擾質(zhì)粒，通過上調(diào)或干擾RNF146檢測肺癌細(xì)胞中Axin和β-catenin的變化，以及上調(diào)和干擾RNF146后對肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、組織來源
　　133例NSCLC肺癌組織和40例癌旁肺組織石蠟標(biāo)本來自2005年1月至2008年12月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院行外科手術(shù)切除的標(biāo)本。其中鱗癌62例，腺癌71例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移73例。Ⅰ期69例，

8、Ⅱ-Ⅲ期64例。20例新鮮肺癌組織和癌旁肺組織來自2010-2011年原發(fā)性肺癌患者外科手術(shù)切除標(biāo)本。癌旁組織距離癌巢達(dá)5cm以上。一部分標(biāo)本在切除后5分鐘內(nèi)取材并迅速置液氮中速凍，然后置于-80℃深凍冰箱保存?zhèn)溆?。另一部分?biāo)本離體后用中性福爾馬林固定。
　　2、支氣管上皮、肺鱗癌和肺腺癌細(xì)胞系
　　正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE，腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所。肺鱗癌細(xì)胞系LK2、LH7和腺癌細(xì)胞系LTE

9、、SPC購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。
　　3、免疫組織化學(xué)染色
　　將石蠟組織切成4μm厚切片，脫蠟，脫水，在PH6檸檬酸鹽修復(fù)液中高溫高壓修復(fù)3分鐘，3％H2O2孵育20分鐘?？筊NF146多克隆抗體、抗Axin和抗β-catenin多克隆抗體4℃孵育過夜。采用EnVision試劑盒檢測抗體結(jié)合。以PBS代替一抗作為陰性對照。DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，封片。
　　4、質(zhì)粒構(gòu)建
　　pEX4-hRNF146和對

10、照pEX4質(zhì)粒，pGPHI-shhRNF146和對照質(zhì)?？蛰d體pGPHI shNC均由GenePharma公司構(gòu)建。si Axin、siβ-catenin和si TCF4購自SantaCruz公司。
　　5、細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　肺癌細(xì)胞系用含10％熱滅活胎牛血清的RPMI1640或DMEM-F12、100U/ml的青霉素、100U/ml的鏈霉素的培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。每2-3天用0.25％胰酶消化傳代。

11、轉(zhuǎn)染前24小時將細(xì)胞按50％密度接種于24孔板，采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑根據(jù)說明書將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和LTE中，Western blot檢測轉(zhuǎn)染效果。
　　6、 RT-PCR
　　將組織或轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞收集，用Trizol Reagent提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA，具體操作步驟按TaKaRa RNA Kit說明書進(jìn)行，提取的基因組DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量后，進(jìn)行P

12、CR反應(yīng)。
　　7、Western blot
　　將含60μg總蛋白的裂解產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5％正常血清封閉，一抗4℃孵育過夜，分別與對應(yīng)的二抗室溫孵育2小時，ECL顯色，結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀采集，進(jìn)行灰度值測定。
　　8、免疫熒光染色
　　固定后的細(xì)胞爬片用0.2％ Triton(Ⅹ)-100處理15分鐘，PBS沖洗，非免疫動物血清封閉30分鐘，滴加一抗，4℃孵育過夜。二

13、抗滴加FITC或TRITC標(biāo)記山羊抗鼠/兔IgG，37℃孵育1小時， DAPI復(fù)染細(xì)胞核。同時設(shè)立陽性和陰性對照。熒光顯微鏡觀察熒光信號，采集圖像。采用IPP軟件進(jìn)行光密度值分析。
　　9、MTT檢測細(xì)胞增殖
　　轉(zhuǎn)染12小時后，將各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞及對照組細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200μl含104個細(xì)胞，培養(yǎng)24小時，使用MTT檢測試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況，連續(xù)檢測4天。吸光度由microplate reader檢測，波

14、長490nm。單純加DMSO試劑的孔作為測量值的內(nèi)參對照，最終值為測量值減去內(nèi)參對照值。繪制細(xì)胞生長曲線。
　　10、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)
　　用marker筆在6孔板背后，大約每隔0.5-1cm均勻地劃橫線。每孔至少穿過5條線。在孔中加入約5×105個細(xì)胞，培養(yǎng)24h后用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕。用PBS洗細(xì)胞3次，加入無血清培養(yǎng)基，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)。按0，6，12，24小時取樣，拍照。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，

15、取平均值。
　　11、Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲
　　取100μl細(xì)胞懸液（2.5×106個/ml）加入上室中，下室加入600μl含10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液。上下室之間用孔徑為8μm的聚碳酸酯微孔濾膜分開，37℃、5％CO2孵育箱中培養(yǎng)6小時后吸盡培養(yǎng)基，PBS清洗，甲醇室溫固定15分鐘，用棉簽擦掉上表面的細(xì)胞，蘇木素染色，室溫干燥過夜，取下聚碳酸酯微孔膜，置載玻片上，鏡下觀察。細(xì)胞侵襲能力的測定用預(yù)冷

16、的無血清RPMI1640培養(yǎng)基以1∶3稀釋Matrigel加入上室100μl，在室溫下放置3小時。培養(yǎng)24小時后觀察結(jié)果。
　　12、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)
　　細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時后，用0.25％的胰酶消化，吹起后收集，在PBS中離心清洗2次，以70％冷乙醇固定。PBS洗2次去除乙醇，在細(xì)胞中加入0.1 mg/ml的RNaseA，37℃，30分鐘，然后加入50mg/L的碘化丙啶1ml染色30分鐘。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA含量和細(xì)胞周期分析

17、。
　　13、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用x2和Fisher檢驗(yàn)對RNF146、Axin、β-catenin在NSCLC和癌旁肺組織中mRNA及蛋白表達(dá)水平及其與臨床病理因素間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。Kaplan-Meier顯示生存曲線，用Log-rank檢驗(yàn)判斷差異性。t檢驗(yàn)用于其它數(shù)據(jù)比較，計(jì)量資料以三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的(x)±s表示。使用Mann-Whitney test和Kruskal-Wallistest統(tǒng)計(jì)Western Blo

18、t、RT-PCR、MTT assay、Matrigelin vasive assay的結(jié)果，以mean±SD表示，以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、RNF146 mRNA和蛋白在NSCLC中過表達(dá)
　　我們用RT-PCR和Western-Blot方法檢測20例配對新鮮NSCLC和癌旁肺組織中RNF146的mRNA及蛋白表達(dá)情況，85％(17/20)的病例RNF146 mRNA的表達(dá)水平明顯高于癌旁肺

19、組織。只有3例顯示癌旁組織中RNF146mRNA的水平與癌組織相當(dāng)或高于癌組織(P=0.030)。80％(16/20)的病例RNF146蛋白表達(dá)量明顯高于癌旁肺組織(P=0.014)。
　　免疫組化檢查顯示133例NSCLC中RNF146高表達(dá)為72例，低表達(dá)為61例。RNF146蛋白陽性表達(dá)信號主要位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。鄰近腫瘤的支氣管粘膜上皮細(xì)胞呈弱或陰性表達(dá)。40例癌旁肺組織中僅有8例RNF146呈弱或中等強(qiáng)度表達(dá)，并且陽

20、性信號定位于正常支氣管粘膜上皮細(xì)胞中，在肺泡上皮細(xì)胞中呈陰性表達(dá)（P＜0.05）。
　　2、RNF146蛋白在NSCLC中的表達(dá)與臨床病理因素及Ⅰ期肺癌患者預(yù)后生存期有關(guān)
　　對133例NSCLC的RNF146表達(dá)與臨床病理因素相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示RNF146蛋白的表達(dá)與腫瘤大小(P=0.044)、組織學(xué)分型(P=0.005)、低分化(P=0.002)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.009)和pTNM分期(P=0.015)相關(guān)。與

21、患者年齡、性別無關(guān)(P＞0.05)。Kaplan-Meier分析RNF146與肺癌患者生存時間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，RNF146的過表達(dá)與Ⅰ期肺癌患者預(yù)后生存期有關(guān)(P=0.016)，RNF146過表達(dá)的Ⅰ期肺癌患者生存率明顯低于RNF146低表達(dá)的患者。與被統(tǒng)計(jì)的全部患者或Ⅱ、Ⅲ期NSCLC患者的生存時間無明顯相關(guān)性。
　　3、人正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE及6種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中存在不同程度的RNF146mRNA和蛋白的表達(dá)
　　

22、RT-PCR和Western-Blot方法檢測了人正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE及6種NSCLC細(xì)胞系中RNF146 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示HBE和LK2（鱗癌）中RNF146 mRNA和蛋白均顯示相對低的表達(dá)，LTE（腺癌）和LH7（鱗癌）中RNF146蛋白呈中等強(qiáng)度表達(dá)，而A549和H1299（均為腺癌）的蛋白水平表達(dá)較高。
　　4、NSCLC組織中RNF146蛋白表達(dá)與Axin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與β-catenin的核表

23、達(dá)呈正相關(guān)
　　免疫組化方法檢測133例NSCLC中Axin和β-catenin的表達(dá)情況顯示，75/133例(56.4％) NSCLC Axin的胞質(zhì)表達(dá)減弱或缺失。72例RNF146高表達(dá)的病例中49例(68.1％) Axin表達(dá)減弱或缺失，RNF146低表達(dá)的61例中只有26例(42.6％) Axin表達(dá)減弱或缺失。RNF146與Axin的表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)(P=0.003)。
　　93/133例(69.9％) NSC

24、LC中β-catenin細(xì)胞膜表達(dá)減少或消失，出現(xiàn)胞質(zhì)的表達(dá)，其中26例(19.5％)出現(xiàn)細(xì)胞核的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，β-catenin細(xì)胞膜表達(dá)的減弱和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的增多與RNF146的表達(dá)無相關(guān)性(P=0.524)。但在72例RNF146高表達(dá)標(biāo)本中19例(26.4％)出現(xiàn)β-catenin細(xì)胞核陽性表達(dá)，61例RNF146低表達(dá)標(biāo)本中只有7例(11.5％)出現(xiàn)核陽性。RNF146的高表達(dá)與β-catenin的細(xì)胞核表達(dá)呈正相關(guān)(P

25、=-0.047)。
　　5、NSCLC中過表達(dá)或干擾RNF146影響Axin的表達(dá)和β-catenin核定位
　　分別在LTE細(xì)胞系中瞬時轉(zhuǎn)染pEX4-hRNF146質(zhì)粒和對照pEX4空質(zhì)粒，上調(diào)RNF146的表達(dá);在A549細(xì)胞系中瞬時轉(zhuǎn)染RNF146 shRNA和對照shNC，干擾RNF146的表達(dá)。轉(zhuǎn)染48小時后，Western-Blot檢測RNF146的轉(zhuǎn)染效率以及Axin和β-catenin的變化。結(jié)果顯示，LTE

26、肺癌細(xì)胞中RNF146的上調(diào)能夠抑制Axin蛋白的表達(dá)，并增加β-catenin的蛋白水平。反之，A549細(xì)胞中干擾RNF146能增加Axin蛋白水平，減少β-catenin蛋白水平。RT-PCR檢測Axin和β-catenin的mRNA水平時沒有發(fā)現(xiàn)這種改變。
　　免疫熒光染色檢測轉(zhuǎn)染后Axin和β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及定位。結(jié)果進(jìn)一步顯示過表達(dá)RNF146的LTE細(xì)胞中，Axin胞質(zhì)表達(dá)減少，β-catenin胞質(zhì)和

27、胞核中的表達(dá)均增多。相反，干擾RNF146的A549細(xì)胞中，Axin胞質(zhì)表達(dá)明顯增多，β-catenin胞質(zhì)和胞核中的表達(dá)均減少。
　　6、RNF146調(diào)節(jié)cyclinD1和cyclinE水平，調(diào)控細(xì)胞周期并促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖
　　LTE和A549細(xì)胞系分別轉(zhuǎn)染pEX4-RNF146和RNF146-shRNA以及各對照質(zhì)粒，MTT觀察各組肺癌細(xì)胞增殖情況。LTE細(xì)胞系轉(zhuǎn)染pEX4-RNF146組細(xì)胞增殖明顯，而空質(zhì)粒組和對照組

28、細(xì)胞增殖相對較慢。shRNF146干擾A549細(xì)胞系后，肺癌細(xì)胞的增殖明顯較對照組慢。流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期變化情況顯示，LTE細(xì)胞系中與對照組和空質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染組的G0/G1期比例明顯減少，S期比例增加。干擾RNF146的A549細(xì)胞系G0/G1期比例增加，S期比例減少。
　　我們用Western-Blot檢測了與細(xì)胞周期相關(guān)的調(diào)控蛋白的表達(dá)情況。上調(diào)RNF146可以使肺癌細(xì)胞cyclin D1，cyclin E and

29、CDK4表達(dá)明顯增多，而對cyclinA、cyclinB、pRB、P21、P27和P53無明顯影響。干擾RNF146后，cyclinD1，cyclinE和CDK4表達(dá)減少。
　　7、RNF146促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移和侵襲，調(diào)節(jié)MMP2和MMP7的變化
　　過表達(dá)和干擾RNF146后，我們采用Wound-healing實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測了LTE和A549肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。Wound-healing結(jié)果顯示

30、24小時LTE轉(zhuǎn)染組劃痕明顯縮小且有融合趨勢。A549干擾組細(xì)胞遷移較對照組和空質(zhì)粒組緩慢。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測肺癌細(xì)胞的遷移侵襲率:LTE轉(zhuǎn)染組遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)都可見到Transwell小室下表面的LTE細(xì)胞穿出率較對照組和空質(zhì)粒組增多。A549細(xì)胞系轉(zhuǎn)染shRNF146，與未處理對照組和空質(zhì)粒組比較，Transwell小室下表面的A549細(xì)胞穿出率減少。
　　Western-Blot方法檢測了過表達(dá)或干擾RNF146后MM

31、P2、MMP7、RhoA、RhoB、RhoC、Rock1、TIMP-1等蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果過表達(dá)RNF146后LTE細(xì)胞內(nèi)MMP2和MMP7表達(dá)明顯增加，而RhoB、RhoC、Rock1、TIMP-1等蛋白的表達(dá)變化不明顯。而干擾RNF146后A549中MMP2和MMP7表達(dá)明顯減少。
　　8、肺癌RNF146通過Wnt/β-catenin途徑調(diào)節(jié)靶蛋白cyclinD1和MMP7的水平
　　在A549細(xì)胞系中干擾RNF14

32、6和Axin，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組比較，在干擾了Axin的細(xì)胞中RNF146的下調(diào)并不能使β-catenin、cyclinD1、cyclinE和MMP7的水平明顯減少。在過表達(dá)RNF146的LTE細(xì)胞中，敲除β-catenin，與對照組比較，盡管Axin水平明顯減少，但也不能明顯增加cyclinD1、cyclinE和MMP7的水平。而對MMP2的影響依然存在。這進(jìn)一步證明RNF146是通過影響Axin和β-catenin，從而調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞增

33、殖和侵襲相關(guān)蛋白。
　　9、肺癌細(xì)胞中RNF146對cyclinD1和MMP7的調(diào)控依賴TCF-4
　　我們在分別過表達(dá)或干擾RNF146的LTE和A549細(xì)胞中干擾TCF-4的表達(dá)水平，然后觀察cyclinD1和MMP7的蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾了內(nèi)源性TCF-4的細(xì)胞系，RNF146的上調(diào)并不能使cyclinD1和MMP7的表達(dá)增多。而在RNF146和TCF-4同時敲除的A549中，cyclinD1和MMP7的表

34、達(dá)明顯減少。這些說明了RNF146對cyclinD1和MMP7的調(diào)控作用是依賴于TCF-4而存在的。
　　結(jié)論：
　　1、RNF146 mRNA和蛋白在NSCLC和細(xì)胞系中過表達(dá)，并與肺癌大小、不良分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和p-TNM分期等臨床病理因素相關(guān);RNF146的過表達(dá)與Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后生存期有關(guān)。
　　2、NSCLC組織中RNF146蛋白表達(dá)與Axin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與β-catenin的核表達(dá)呈正相關(guān)。肺癌細(xì)