X射線輻照對小鼠睪丸組織中RNF146表達(dá)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、電離輻射對男性生殖健康的影響，已受到了廣泛關(guān)注。睪丸作為對電離輻射高度敏感的器官，在接受一定劑量以上的電離輻射后會出現(xiàn)不同程度的結(jié)構(gòu)和功能損傷，引起精子發(fā)生障礙，健康精子數(shù)量顯著減少，從而形成暫時甚至永久不育[1]。目前普遍認(rèn)為精原細(xì)胞損傷是睪丸接受一定劑量以上射線輻照后生精障礙的重要原因[2]，因此，闡明電離輻射所致精原細(xì)胞損傷的分子機(jī)制，有助于深入理解睪丸輻射損傷的發(fā)生機(jī)理。
　　前期研究中我們發(fā)現(xiàn)了一種特異性表達(dá)于小鼠睪丸組

2、織的E3泛素連接酶—RNF146。泛素化是一種廣泛存在于真核生物中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，不同的E3泛素連接酶能夠作用于不同的蛋白底物，催化特定的氨基酸殘基被泛素分子標(biāo)記，進(jìn)而被蛋白酶體識別，特異性降解[3]。RNF146作為一種DNA損傷反應(yīng)蛋白，序列高度保守[4]。研究提示，RNF146能夠特異性識別結(jié)合凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis induc ing factor，AIF），促進(jìn)AIF發(fā)生泛素化修飾，進(jìn)而在胞質(zhì)中誘導(dǎo)其降解，修

3、復(fù)各種因素引起的DNA損傷，抑制細(xì)胞的凋亡[5]。
　　我們前期的研究發(fā)現(xiàn)RNF146的表達(dá)水平與小鼠性腺發(fā)育密切相關(guān)，在新生小鼠睪丸組織中RNF146表達(dá)極低，隨著性發(fā)育其表達(dá)水平迅速升高[4]。組織病理學(xué)研究顯示睪丸組織中RNF146主要定位于精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中。RNF146在DNA復(fù)制非?；钴S的睪丸組織中高表達(dá)的意義是什么？大劑量X線輻照后睪丸組織中RNF146表達(dá)下調(diào)對睪丸功能的影響如何？其分子機(jī)制是什么？
　　上

4、述問題的回答，有助于我們深入理解RNF146在睪丸輻照損傷進(jìn)程中的作用和意義。為此，我們進(jìn)行了下列兩部分研究工作：
　　第一部分：X射線輻照對小鼠睪丸損傷及RNF146表達(dá)的影響
　　目的：
　　觀察不同劑量X射線輻照對正常小鼠睪丸組織形態(tài)和功能以及RNF146表達(dá)的影響。
　　方法：
　　取成年雄性C57小鼠240只，隨機(jī)分為6組，每組40只，分別給予0、0.1、0.5、1.0、2.0和4.0 Gy X射

5、線輻照，通過HE染色觀察不同劑量X射線輻照后16h、48h及45d小鼠睪丸組織形態(tài)變化；Tunel染色評價X射線輻照后16 h及48 h小鼠睪丸生精細(xì)胞的凋亡情況；q-PCR實驗檢測RNF14616h和48h mRNA的表達(dá)；45d后雄鼠與雌鼠1∶2合籠，根據(jù)輻照后雄鼠致正常雌鼠的受孕情況評價輻照對小鼠生育能力的影響。取成年雄性C57小鼠50只，隨機(jī)分為5組：Blank，2Gy16h，2Gy48h，4Gy16h以及4Gy48h，每組10

6、只。所有小鼠全部摘取左側(cè)睪丸，-80℃凍存，術(shù)畢1周后分別給予0、2、4 Gy X射線輻照，輻照后16h和48h取小鼠右則對應(yīng)睪丸，Western-blot分析評價X射線輻照對小鼠睪丸組織中RNF146蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　HE染色結(jié)果顯示，X射線輻照后16h，各組睪丸組織無明顯形態(tài)學(xué)改變；輻照后48h，1Gy組可見胞核深染、固縮及碎裂，2Gy以上劑量組睪丸組織出現(xiàn)生精細(xì)胞形態(tài)異常，數(shù)量減少；45天后2Gy以下輻

7、射劑量睪丸組織組織形態(tài)變化不大，2Gy有明顯損傷，4Gy睪丸生精小管有嚴(yán)重的空管，管腔皺縮變小。合籠結(jié)果提示2Gy及以下輻射損傷對小鼠生育能力無明顯影響，4Gy輻照后小鼠生育能力顯著降低。Tunel染色提示4Gy射線輻照后睪丸細(xì)胞凋亡主要發(fā)生于外層的精原細(xì)胞及精母細(xì)胞。q-PCR、Western-blot實驗表明2Gy和4Gy射線輻照后48h RNF146表達(dá)水平整體出現(xiàn)下降趨勢。
　　結(jié)論：
　　小鼠在接受2Gy以上劑量的

8、X射線輻照后睪丸組織會出現(xiàn)損傷，且短期內(nèi)無法修復(fù)，4Gy輻照后損傷嚴(yán)重，雄性小鼠絕育率高達(dá)96%，射線輻照誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡，同時伴隨著RNF146表達(dá)下調(diào)。
　　第二部分：X射線輻照誘導(dǎo)小鼠精原細(xì)胞GC1凋亡及凋亡誘導(dǎo)因子AIF核轉(zhuǎn)位
　　目的：
　　本實驗以GC1小鼠精原細(xì)胞為細(xì)胞模型，研究X射線輻照所引起的GC1小鼠精原細(xì)胞的凋亡及凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）細(xì)胞定位的變化。
　　方法：
　　將對數(shù)生長期的精

9、原細(xì)胞細(xì)胞株GC1，分別接種至培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板中，分別給予0、3、6、9 Gy X射線輻照，通過溴脫氧尿苷（BrdU）摻入實驗檢測輻射對細(xì)胞增殖速率的影響；輻射后48 h，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色觀察細(xì)胞核凝集情況，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測證胞質(zhì)及胞核中AIF蛋白定位的變化，Western blot分析細(xì)胞總蛋白、胞質(zhì)蛋白及核提取物中AIF蛋白的水平、RNF146總蛋白的變化以及二者表達(dá)水平的相關(guān)性；通過慢病毒過表達(dá)

10、GC1細(xì)胞中的RNF146，給予9Gy射線輻照，Western blot檢測驗證RNF146對AIF定位的影響。
　　結(jié)果：
　　隨著輻射劑量的增加，GC1細(xì)胞增殖速率顯著減慢，細(xì)胞活性降低。6Gy及9Gy X射線輻照后全細(xì)胞提取物中AIF蛋白總量變化不大，但細(xì)胞核提取物中AIF顯著增多，即AIF出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象。RNF146隨著射線劑量的增加表達(dá)降低，9Gy輻照組最明顯。過表達(dá)RNF146后，能夠抑制AIF的核轉(zhuǎn)位。