Diversin通過JNK促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖和侵襲能力.pdf

1、前言：
　　Diversin也被稱作錨蛋白重復(fù)序列包含蛋白6(ANKRD6)，它是果蠅屬Diego蛋白在哺乳動(dòng)物中的同源異構(gòu)體，同時(shí)參與經(jīng)典Wnt/beta-catenin通路和非經(jīng)典Wnt/JNK通路（即PCP通路）。而Diego則是PCP通路的核心蛋白，它與Fz-Dsh信號相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在新生小鼠和成鼠腦內(nèi)，Diversin表達(dá)于室下區(qū)和海馬區(qū)的神經(jīng)母細(xì)胞和成熟神經(jīng)元，并證實(shí)Diversin可以促進(jìn)其增殖活性。在胚胎發(fā)育過程中

2、Diversin通過非經(jīng)典Wnt/JNK通路調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎的原腸胚運(yùn)動(dòng)以及控制心臟前體的融合。Diversin作為一個(gè)分子開關(guān)，可以抑制經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)非經(jīng)典的Wnt/JNK通路。另外，Diversin含有一些核定位信號，轉(zhuǎn)移入核后可以和轉(zhuǎn)錄因子AF9相互作用，而AF9能夠顯著增加Diversin引起的JNK活性增加。Wnt和PCP信號成員可以調(diào)控Diversin的亞細(xì)胞定位從而影響其在通路中的作用。Diver

3、sin蛋白位于細(xì)胞的中心小體，這種獨(dú)特的細(xì)胞器以及衍生的纖毛在許多信號通路，包括Hedgehog, Wnt，PDGF和FGF中扮演了重要的角色。
　　目前Diversin在人類腫瘤中的表達(dá)情況及意義尚不清楚，其是否具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖或侵襲的能力及分子機(jī)制等都有待于進(jìn)一步探討。在本研究中，我們用免疫組化和western blot等方法檢測了Diversin蛋白在肺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，通過雙向調(diào)控Diversin的表達(dá)，分別檢測

4、Diversin對經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt通路中重要蛋白的影響，初步探討了Diversin對肺癌細(xì)胞增殖侵襲的影響和可能的作用機(jī)制。
　　材料與方法：
　　一、組織標(biāo)本與患者資料
　　167例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織和38例癌旁正常肺組織均來自于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2004-2006年存檔蠟塊。在167例肺癌病例中具有完整隨訪資料的74例。隨訪是從手術(shù)之日起到隨訪結(jié)束日期或由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡之日止?；颊撸?

5、06例男性，61例女性）年齡29-81歲，中位年齡60歲。根據(jù)第七版國際抗癌聯(lián)盟肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期56例，Ⅱ期32例，Ⅲ期74例，Ⅳ期5例。根據(jù)WHO2004肺癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，腺癌94例，鱗癌73例。所有患者術(shù)前均未接受化療或放射治療。為用于蛋白質(zhì)分析，另收集20例新鮮的肺癌組織及相對應(yīng)的癌旁正常的肺組織，保存在-70℃冰箱內(nèi)。
　　二、免疫組織化學(xué)染色
　　手術(shù)切除的組織均經(jīng)過10％中性福爾馬林固定后，石蠟包埋，制

6、成4μm切片，采用SP免疫組化法進(jìn)行染色。一抗使用鼠源性的Diversin，以1∶100(Anti-Diversin購于Santa Cruz Biotechnology， USA)4℃孵育過夜。以PBS代替一抗作為空白對照。生物素標(biāo)記的二抗IgG(Fuzhou，China)37℃孵育20min，DAB顯色。結(jié)果判定:每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞。根據(jù)計(jì)數(shù)細(xì)胞著色的百分比，將Diversin的表達(dá)劃分為5個(gè)等級:無

7、著色為0分，1％-25％為1分，26％-50％為2分，51％-75％為3分，76％以上為4分。再根據(jù)細(xì)胞著色的強(qiáng)度，將Diversin的表達(dá)劃分3個(gè)等級:無著色為0分，淺黃色顆粒為1分，深黃色或者黃褐色顆粒為2分。將二者相乘，所得乘積即為該切片的最終得分。Diversin陽性表達(dá)定位于胞漿和胞膜。根據(jù)38例正常的支氣管上皮染色后，其得分均為＜3分，于是實(shí)驗(yàn)中將得分＜3分的計(jì)為陰性表達(dá)（正常表達(dá)），而得分≥3分的計(jì)為陽性表達(dá)（高表達(dá)）。<

8、br>　　三、細(xì)胞培養(yǎng)
　　A549，H1299 and H157細(xì)胞系購于美國標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)所(Manassas,VA，USA);SPC-A-1、LTEP-A-2和正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE購于上海細(xì)胞庫（Shanghai，China）;PG-BE1和PG-LH7由北醫(yī)鄭杰教授饋贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)基采用RPMI1640(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，其中含10％熱滅活新鮮小牛血清(Invitrogen)，用25

9、cm培養(yǎng)瓶在5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每兩天用0.25％胰酶(Invitrogen)消化傳代。
　　四、質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染
　　pcDNA3.1-HA-Diversin質(zhì)粒由Walter Birchmeier教授(Max Delbrueck-Centerfor Molecular Medicine，Berlin，Germany)惠贈(zèng)。 Diversin siRNA由上海吉瑪合成，轉(zhuǎn)染試劑lipo2000購于Invitrogen(C

10、arlsbad，CA，USA).siRNA干擾序列如下:ANKRD6-HOMO-2171:5'GAGGCACUCAAACUAAGAATT3',5'UUCUUAGUUUGAGUGCCUCTT3'ANKRD6-HOMO-1428:5'GAACCUGCAUGCUCAUAAUTT3',5'AUUAUGAGCAUGCAGGUUCTT3'ANKRD6-HOMO-883:5'GCGCGCUAUAAUCACUUGUTT3',5'ACAAGUGAUUAU

11、AGCGCGCTT3'NC:5'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3',5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3'。
　　五、Western Blotting
　　將收集的培養(yǎng)細(xì)胞或剪成2mm的肺癌組織塊用細(xì)胞裂解液(Pierce，Rockford，IL，USA)裂解后提取總蛋白，用Bradford method進(jìn)行定量，10％SDS-PAGE電泳，上樣量為80ug，轉(zhuǎn)印到PVDF膜(Millipore, B

12、illerica，MA，USA)，一抗4℃過夜，二抗37℃，2h，ECL發(fā)光后，Bio-Image system(EpiChemiⅢ Darkroom，UVP)進(jìn)行條帶灰度值測定，以與GAPDH的比值作為相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取均值。
　　六、Real-Time PCR
　　使用ABI7900實(shí)時(shí)定量PCR儀，采用SYBR primescript RT-PCR KitⅡ(TakaraBiotechnology)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和

13、PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為95℃ for30 see，40 cycles of95℃ for5 sec,60℃ for30 Sec。
　　七、MTT
　　在96孔板中用含10％血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)約4000個(gè)左右的轉(zhuǎn)染24小時(shí)后的LTE、H1299細(xì)胞，每個(gè)孔加入50微升的5 mg/ml MTT(Thiazolyl Blue)溶液，在37℃孵育4小時(shí)后，去除溶液，用150微升的DMSO溶解生成的MTT結(jié)晶，用分光光度計(jì)檢測550nm

14、波長的吸收峰值進(jìn)行定量。
　　八、細(xì)胞基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)
　　在24孔板中以雙無的1640培養(yǎng)基按照1∶3的比例稀釋基質(zhì)膠(BDBiosciences)，鋪8微米孔徑的上室(Costar)。然后將轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的LTE、H1299以100微升含有3×105個(gè)的細(xì)胞密度接種在上室并孵育。下室放含有10％小牛血清的培養(yǎng)基。6小時(shí)后，加入JNK抑制劑(SP600125)30μM。孵育20小時(shí)后，甲醇固定15分鐘，蘇木素染色。隨機(jī)選取1

15、0個(gè)視野，計(jì)數(shù)侵襲到小室下的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。
　　九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有的數(shù)據(jù)采用SPSS17.0版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Chi-Square檢驗(yàn)Diversin表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)聯(lián)。采用t檢驗(yàn)檢測Western Blot結(jié)果中的灰度值。采用Kaplan-Meier法檢測Diversin對患者生存時(shí)間的影響。P＜0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、Diversin蛋白過表達(dá)與

16、非小細(xì)胞肺癌分化、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)
　　免疫組化結(jié)果顯示38例正常肺組織中Diversin均為陰性表達(dá)，而肺癌組織中Diversin陽性率為67.67％(113/167)，二者具有明顯的差異(P＜0.001)，并且其高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的低分化（高分化:中-低分化P=0.006）、高p-TNM分期(Ⅰ-Ⅱ∶Ⅲ-Ⅳ P=0.030)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.048)和不良預(yù)后（Kaplan-Meier生存分析，P=0.00

17、7）密切相關(guān)。Western blot結(jié)果顯示在7種肺癌細(xì)胞系中5種diversin蛋白表達(dá)明顯高于正常支氣管細(xì)胞系HBE;在20對非小細(xì)胞肺癌新鮮配對組織中，有14例癌表達(dá)高于癌旁組織(70％)。
　　二、轉(zhuǎn)染Diversin促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和侵襲
　　我們在diversin表達(dá)相對較低的肺癌細(xì)胞系LTE中轉(zhuǎn)染diversin質(zhì)粒，而在表達(dá)相對較高的肺癌細(xì)胞系H1299中轉(zhuǎn)染特異性siRNA，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，與

18、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染diversin質(zhì)粒的細(xì)胞在增殖能力（0.51±0.02 VS0.69±0.01 P＜0.05）和侵襲能力明顯增強(qiáng)(12±2 VS45±5 P＜0.05)。而轉(zhuǎn)染特異性siRNA的細(xì)胞，增殖能力明顯下調(diào)（0.63±0.02 VS0.53±0.01 P＜0.05），侵襲能力也出現(xiàn)了明顯抑制(97±5 VS44±6 P＜0.05)。
　　三、Diversin通過JNK促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖與侵襲能力
　　轉(zhuǎn)染

19、diversin質(zhì)粒的肺癌細(xì)胞P-JNK/JNK水平明顯增加，而P-P38/P38、beta-catenin和TCF-4變化不大;相反在轉(zhuǎn)染特異性siRNA的肺癌細(xì)胞P-JNK/JNK水平明顯降低，而P-P38/P38、beta-catenin和TCF-4也沒有顯著變化。我們在轉(zhuǎn)染diversin質(zhì)粒后又加入JNK抑制劑SP600125（30μM），這時(shí)磷酸化JNK水平受到明顯抑制，此時(shí)MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞增殖能力明顯減弱(DMS

20、O0.51±0.03 VS0.59±0.02;SP6001250.48±0.02 VS0,49±0.03)，同時(shí)transwell檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的侵襲能力亦受到明顯抑制（DMSO11±3 VS43±4;SP6001259±2VS14±3）。
　　結(jié)論：
　　1、Diversin在NSCLC組織中高表達(dá)并與患者的不良預(yù)后相關(guān)。
　　2、轉(zhuǎn)染Diversin可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖和侵襲。
　　3、Diversi