美伐他汀對非小細胞肺癌細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制作用及其放化療增敏作用.pdf

1、肺癌已占據(jù)全球癌癥死亡的首位，發(fā)病率和病死率逐年上升，其中非小細胞肺癌fNSCLC)占肺癌總數(shù)的80％，其惡性度高，對放療、化療不敏感，5年生存率不足15％。研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤細胞對膽固醇及其前體物質(zhì)的濃度要求較高，所以限制膽固醇的合成和利用，可作為腫瘤預防和治療的輔助手段。美伐他汀(mevastatin，M)屬HMG-CoA還原酶抑制劑，是甲羥戊酸(mevalonate,MVA，系類異戊二烯的前體)合成途徑的限速酶。另外，甲羥戊酸還是

2、除膽固醇外，長醇、泛醌等多種生物合成類異戊二烯化合物的前體。甲羥戊酸衍生物即類異戊二烯類化合物可以影響Ras和Rho。蛋白的細胞膜精確定位，它們構成細胞膜的結構并維持其完整性，并參與細胞的增殖、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導和抑制腫瘤細胞侵襲等重要生物學功能。近年來，研究發(fā)現(xiàn)美伐他汀可抑制多種惡性腫瘤細胞(如結腸癌細胞、HL-60 細胞)的增殖并誘導凋亡，并可以起到抑制腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移的作用。同時發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可以增強某些細胞毒藥物以及放療和化療的

3、抗腫瘤作用，而且并不影響正常組織的功能。迄今為止，他汀類藥物這些作用的確切分子機制尚不完全清楚。本研究擬探討了美伐他汀對NSCLC增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制作用及其放化療增敏作用，旨在為美伐他汀的臨床應用提供理論依據(jù)，為NSCLC的治療提供新的思路。 本實驗分為如下四個部分： 第一部分：美伐他汀對非小細胞肺癌細胞體外增殖的影響 目的：研究美伐他汀對非小細胞肺癌細胞體外增殖的影響和影響機制。 方法：1．四唑氮

4、藍比色試驗(MTT)檢測美伐他汀對肺腺癌細胞株A549和肺鱗癌細胞株NCI-H520的體外增殖抑制作用。2．流式細胞儀檢測美伐他汀對NSCLC細胞周期影響。3．應用RT-PCR 方法和流式細胞學檢測P21mRNA和蛋白的表達。 結果：1．美伐他汀對肺腺癌細胞株A549和肺鱗癌細胞株NCI-H520均有明顯的體外增殖抑制作用，IC<,50>值均為50μmol/L，而且隨美伐他汀劑量的增大和作用時間的延長，抑制作用明顯增強，即有明顯

5、的時間和劑量依賴關系。2.隨著美伐他汀作用劑量加大，細胞周期發(fā)生改變，G<,0>/G<,1>期細胞明顯增加，說明美伐他汀可以引起NSCLC細胞周期阻滯。A549 和NCI-H1520細胞經(jīng)25-100 ummol/L 美伐他汀作用后，G<,0>/G<,1>細胞比例分別為44.46％、68.15％、71.16％和48.48％、70.24％、82.86％，明顯高于對照(P<0.05，P<0.01)。3加入外源性甲羥戊酸可完全逆轉(zhuǎn)美伐他汀對A

6、549和NCI-H520細胞株的生長抑制作用和對其細胞周期的影響。4.美伐他汀作用后A549與NCI-H520細胞各組P21 mRNA的表達水平均無明顯變化；P21 胞膜蛋白進行性下降(P<0.05，P<0.01)，成劑量依賴性；而P21總蛋白表達無明顯變化(P>0.05)。 結論：1.美伐他汀對非小細胞肺癌細胞株有明顯的增殖抑制作用，且呈劑量和時間依賴性。2.美伐他汀對非小細胞肺癌細胞的抑制作用與其誘導細胞周期阻滯有關。3.加

7、入外源性MVA可以完全消除美伐他汀對A549、NCI-H520細胞增殖、細胞周期分布的影響，說明美伐他汀對NSCLC 細胞增殖的抑制作用是通過抑制甲羥戊酸的合成介導的。4.美伐他汀通過影響ras蛋白的異戊二烯化，即P21蛋白的膜定位，達到抑制NSCLC細胞增殖的作用。 第二部分：美伐他汀對非小細胞肺癌細胞凋亡的影響 目的：研究美伐他汀對非小細胞肺癌細胞凋亡的影響和影響機制 方法：1.應用流式細胞術、丫啶橙雙色熒光

8、顯微鏡和電鏡分析檢測了美伐他汀對非小細胞肺癌細胞凋亡的影響，2.采用RT-PCR 技術分析了美伐他汀作用后凋亡相關因子XIAP、Survivin mRNA的表達3.采用western blot 技術分析了美伐他汀作用Survivin蛋白的表達。 結果：1.丫啶橙雙色熒光染色顯示美伐他汀作用于A549和 NCI-H520細胞48小時，均出現(xiàn)不同程度的早期凋亡細胞和少量中晚期凋亡細胞(呈現(xiàn)橙色熒光，可見核的斷裂和濃縮)，而且隨美伐他

9、汀劑量的增大，改變越明顯。其中晚期凋亡細胞百分率分別為8.17％、21.83％和29.53％和18.58％、21.67％和36.39％，凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)。2.透射電鏡從形態(tài)學上證實美伐他汀作用NSCLC細胞后可以出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學改變：50μmol/L 美伐他汀處理A549 48h后，出現(xiàn)早期凋亡細胞的形態(tài)的改變。 細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡變性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，有出芽現(xiàn)象。100μmol/L 美伐他汀處理A549和NCI-H

10、520細胞48h后出現(xiàn)典型的凋亡細胞，表現(xiàn)為外形不規(guī)則，體積明顯縮小，胞漿濃縮，核碎裂，染色質(zhì)邊緣化、染色質(zhì)濃集。3．流式細胞儀檢測25-100μmol/L 美伐他汀作用于A549和NCI-H520 細胞后其凋亡率明顯增高(P<0.05)，呈劑量依賴性。加入外源性甲羥戊酸后A549和NCI-H520 細胞凋亡率與對照組比較結果均無顯著性差異。 4．細胞周期的改變：細胞周期檢測亞G<,1>峰發(fā)現(xiàn)：隨著美伐他汀作用劑量加大A549和NCI-

11、H520 細胞亞Gl峰越來越明顯。5．50-100μmol/L 美伐他汀作用48小時后，NSCLC細胞的survivin mRNA及蛋白的表達逐漸降低，呈劑量依賴性。6．25-100μmol/L美伐他汀作用24小時后，NSCLC細胞的XIAP mRNA的表達逐漸降低，成劑量依賴性。 結論：1．美伐他汀作用NSCLC細胞后可以出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學及流式細胞學變化，即美伐他汀可以誘導NSCLC細胞發(fā)生凋亡。2．美伐他汀誘導NSCLC細胞

12、凋亡的機制可能與降低XIAP、survivin的表達有關。3．加入外源性MVA可以完全消除美伐他汀對A549、NCI-H520細胞凋亡的影響，說明美伐他汀誘導NSCLC細胞凋亡的機制是通過抑制甲羥戊酸的合成介導的。 第三部分：美伐他汀對NSCLC細胞體外粘附能力和侵襲力的影響 目的：研究美伐他汀對非小細胞肺癌細胞體外粘附能力和侵襲力的影響 方法：1 應用粘附試驗、Transwell法檢測美伐他汀對NSCLC 細胞

13、株的體外粘附和侵襲能力的影響。2 應用western blot 方法檢測MNIP和NF-kB蛋白的表達探討美伐他汀影響NSCLC細胞株粘附和侵襲能力的機制。 結論：1．美伐他汀可降低NSCLC細胞的體外粘附能力。2．美伐他汀可以抑制NSCLC細胞的體外侵襲能力，3．美伐他汀抑制 NSCLC 細胞的粘附和體外侵襲能力，其機制可能與減少MMP-9、MMP-2、NF-kB P65蛋白表達有關。 第四部分美伐他汀對非小細胞肺癌的

14、放療和化療的增敏作用及機制 目的：探討美伐他汀對NSCLC的放療和化療增敏作用及其機制。 方法：1．MTT法和流式細胞術檢測放療、順鉑(DDP)、足葉乙甙(VP16)單獨應用的增殖抑制率及與美伐他汀聯(lián)合應用的增殖抑制率，并根據(jù)金氏公式計算 Q 值，評價兩藥的合用效應，檢測了美伐他汀對NSCLC的放療和化療的影響，2．應用Western印跡法檢測p53蛋白在其中發(fā)揮的作用，探討美伐他汀對NSCLC放療和化療增敏的作用機制。