丹皮酚增強化療藥物對人肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用及其可能機制.pdf

1、肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，近二十年來，我國HCC的死亡率增加了41.7％，約占全世界HCC死亡人數(shù)的42％。目前，手術(shù)切除仍是治療HCC的最佳手段，但本病起病隱匿，病情發(fā)展迅速，大多數(shù)患者就診時己發(fā)展到中晚期，失去了手術(shù)治療的機會，患者5年生存率低于10％。而順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶等臨床一線化療藥物療效不理想，有效率不超過20％，且大劑量時可引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，從

2、而限制了臨床應(yīng)用及療效的進(jìn)一步提高。近年來從中藥和其他天然產(chǎn)物中尋求高效、低毒的有效物質(zhì)以及探討這些物質(zhì)與現(xiàn)有化療藥物的相互作用是目前研究的熱點。丹皮酚(Paeonol，Pae)又稱牡丹酚，是毛莨科植物牡丹PaeoniaSuffruicosaAndr.根皮和蘿摩科植物徐長卿PycnostelmaPaniculatum(Bunge)K.Schum干燥根或全草的主要有效成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，Pae具有鎮(zhèn)靜催眠、解熱鎮(zhèn)痛、抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)

3、、抗氧化及保護(hù)心腦血管等廣泛的藥理活性。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，Pae對體外培養(yǎng)的多種腫瘤細(xì)胞的增殖有較強的抑制作用，體內(nèi)應(yīng)用有抗腫瘤作用。本研究選用人肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC-7721作為研究對象，探討Pae及Pae與順鉑等化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對人肝癌細(xì)胞增殖的影響及其可能機制，為將Pae應(yīng)用于HCC的治療提供初步的實驗依據(jù)。 1.Pae對人肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC-7721增殖的影響選用人肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC

4、-7721，采用MTT法檢測了Pae體外抑制人肝癌細(xì)胞株增殖的量效和時效關(guān)系。結(jié)果顯示：(1)Pae(7.81～250mg·L-1)對上述兩種細(xì)胞均有增殖抑制作用，藥物濃度越高，抑制作用越強，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。以濃度的對數(shù)與抑制率進(jìn)行直線相關(guān)分析：HepG2：r=0.9637，P＜0.01；SMMC-7721：r=0.9439，P＜0,01，IC50值分別為HepG2：58.948mg·L-1，SMMC-7721：89.275mg

5、·L-1。(2)系列濃度Pae作用于細(xì)胞12h、24h、48h、72h及96h后觀察細(xì)胞的生長情況，結(jié)果顯示Pae作用時間越長，對上述細(xì)胞的抑制作用越強，呈時間依賴性。 2.Pae與順鉑(cisplatin,CDDP)、多柔比星(doxorubicin，DOX)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)聯(lián)合應(yīng)用對人肝癌細(xì)胞增殖的影響選用三個濃度Pae(15.63、31.25、62.5mg·L-1)分別與系列濃度CD

6、DP、DOX以及5-FU聯(lián)合應(yīng)用處理HepG2和SMMC-7721細(xì)胞，采用CDI分析兩藥相互作用性質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在合適的劑量下，Pae與三種化療藥物均顯示出不同程度的協(xié)同作用(CDI＜1)，但Pae對三種化療藥物的增效作用各不相同。 3.Pae增效作用的可能機制探討3.1Pae與CDDP聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變采用吖啶橙(acridineorange，AO)熒光染色，觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。在熒光顯微鏡下可見未處理

7、的腫瘤細(xì)胞增殖旺盛，細(xì)胞質(zhì)和核仁內(nèi)有大量RNA，被染為桔黃或桔紅色熒光，細(xì)胞核中有大量DNA，表現(xiàn)為黃綠色熒光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征；藥物處理組作用24h后，細(xì)胞密度減少，并可見典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)特征：核固縮、體積縮小和表面起泡，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見致密濃染的黃綠色熒光，聯(lián)合用藥組誘導(dǎo)凋亡作用較單獨用藥組明顯增強。 3.2Pae與CDDP聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的瓊脂糖凝膠電泳分析應(yīng)用DNA凝膠電泳法，檢測Pae、CDDP以及兩

8、者聯(lián)合應(yīng)用引起的DNA斷裂。藥物處理HepG2和SMMC-7721細(xì)胞24h后，瓊脂糖電泳可見DNA梯狀條帶(DNAladder)，大約相當(dāng)于180～200bp的整倍數(shù)，提示DNA在核小體間斷裂，呈細(xì)胞凋亡的典型特征，而培養(yǎng)相同時間的細(xì)胞對照組無DNA梯狀條帶，聯(lián)合用藥組較單獨用藥組梯狀條帶明顯。 3.3Pae與GDDP聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀分析應(yīng)用流式細(xì)胞儀(FlowCytometry,FCM)檢測細(xì)胞凋亡率。P

9、ae單獨應(yīng)用可誘導(dǎo)人肝癌HepG2和SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生凋亡，在DNA直方圖上G0/G1期前可見亞G1峰即凋亡峰，其誘導(dǎo)凋亡作用呈現(xiàn)明顯的濃度、時間依賴關(guān)系。Pae與CDDP聯(lián)合應(yīng)用24h后凋亡率明顯高于單獨用藥組，提示兩藥合用對誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡有協(xié)同作用。 3.4Pae對細(xì)胞周期的影響應(yīng)用Mcycle軟件分析Pae作用后細(xì)胞周期的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pae可引起人肝癌細(xì)胞S期細(xì)胞大量堆積，G0/G1期細(xì)胞比例明顯下降，上述