siRNA靶向沉默hTERT對肺癌細胞增殖的抑制作用.pdf

1、目的：
　　 (1)檢測不同病理類型肺癌細胞株中hTERT mRNA表達情況，探討hTERTmRNA隨著原代細胞傳代的變化并篩選出表達量較高的肺癌細胞系進行后期實驗。
　　 (2)設計并化學合成3對靶向hTERTmRNA的siRNA序列并轉(zhuǎn)染入95D細胞中，探討hTERTmRNA-siRNA對hTERT基因的沉默和肺癌細胞的增值抑制作用，并篩選出具有高效干擾效果的siRNA序列。
　　 (3)將hTERT mRN

2、A-siRNA重組入質(zhì)粒介載體中，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到肺癌H1299細胞，探討在肺巨細胞癌95D細胞株中篩選出的siRNA序列在肺腺癌H1299細胞是否具有干擾效應，siRNA干擾作用是否在不同癌癥的病理類型存在差異。
　　 方法：
　　 (1)培養(yǎng)多種不同類型的肺癌細胞株及從肺癌病人組織中獲取的原代細胞株，用TRIZOL法提取細胞總RNA。然后運用RealTime RT-PCR法檢測各細胞株中hTERTmRNA的表達，并對熒光

3、定量PCR后的擴增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳。
　　 (2)設計3對hTERT mRNA-siRNA分別轉(zhuǎn)染95D細胞，分別運用Real Time RT-PCR技術(shù)、western blot技術(shù)、MTT、流式細胞儀等方法比較轉(zhuǎn)染前后及轉(zhuǎn)染不同siRNA序列細胞中hTERT mRNA表達、hTERT蛋白表達、細胞周期間差異。篩選出高效的siRNA序列。
　　 (3)構(gòu)建siRNA表達載體，通過脂質(zhì)體的方法將重組siRNA表達載體

4、及空白載體轉(zhuǎn)染到肺癌H1299細胞，G418篩選、單克隆之后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。分別運用Real Time RT-PCR技術(shù)、western blot技術(shù)、MTT、流式細胞儀等方法比較重組siRNA表達載體及空白載體組細胞中hTERT mRNA表達、hTERT蛋白表達、細胞周期間差異。進一步驗證篩選出的siRNA的高效性。
　　 結(jié)果：
　　 (1)在肺癌細胞中，hTERT mRNA均有表達，其中肺巨細胞癌細胞95D表達最

5、高;而對于肺癌原代細胞，隨著傳代次數(shù)的增加，hTERT mRNA表達逐漸下降。
　　 (2) hTERT siRNA轉(zhuǎn)染95D細胞48小時后（轉(zhuǎn)染濃度為100nmol/L），與空白脂質(zhì)體對照組和陰性對照組比較，siRNA-1和siRNA-2均明顯抑制了hTERT mRNA表達(P值均小于0.01)，抑制率分別為77.33±5.13％和50.67±8.02％，siRNA-3抑制率較低，僅為27.67±10.26％。
　　

6、(3)選取抑制效果最顯著的hTERTsiRNA-1對95D肺癌細胞進行由低到高3個濃度的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染濃度分別為50nmol/L，80nmol/L，100nmol/L。50nmol/L濃度轉(zhuǎn)染組與陰性對照組之間hTERT mRNA表達量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。80nmol/L組、100nmol/L濃度轉(zhuǎn)染組分別與陰性對照組比較，hTERT mRNA表達量差異均有統(tǒng)計學意義（P值均小于0.01），而這兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0

7、.05)。
　　 (4)轉(zhuǎn)染48h后，與空白脂質(zhì)體對照組比較，50nmol/L、80mol/L、100nmol/L濃度的hTERT siRNA-1轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率均顯著增加（P值均小于0.01）。與陰性對照組比較，50nmol/L濃度轉(zhuǎn)染組的細胞凋亡率無顯著增加(P＞0.05)，而80nmol/L、100nmol/L組細胞凋亡率顯著增加（P值均小于0.01）?？瞻字|(zhì)體對照組與陰性對照組比較亦有顯著差異(P＜0.05)。

8、　　 (5)MTT檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染12小時后肺癌細胞增殖抑制作用開始顯現(xiàn)，但效果尚弱，24小時已較明顯，48小時最顯著，72小時抑制效果轉(zhuǎn)弱。hTERT siRNA可以有效抑制肺癌細胞增殖，抑制效應具有時間依賴性。
　　 (6)pGenesil.1-hTERT轉(zhuǎn)染H1299細胞經(jīng)單克隆后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株H1299-pGenesil.1-hTERT和H1299-pGenesil.1。與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒細胞組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染si

9、RNA質(zhì)粒細胞的hTERT mRNA表達量顯著下降，抑制率為93.97±0.83％，P＜0.01。
　　 (7)肺癌H1299-pGenesil.1-hTERT細胞較H1299-pGenesil.1細胞hTERT蛋白的表達受到明顯抑制。
　　 (8)肺癌H1299-pGenesi1.1-hTERT細胞較H1299-pGenesil.1細胞增殖能力降低。
　　 (9)H1299-pGenesil.1-hTERT細胞

10、與對照組H1299-pGenesil.1比較，G1期細胞增多，比對照組增加了18.3％(P＜0.05)，S、G2期細胞分別少了10.4％、7.9％(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1) hTERT基因在不同類型肺癌細胞均有表達;隨著原代肺癌細胞的傳代培養(yǎng)傳代增加，hTERT表達量逐漸下降。
　　 (2)人肺癌細胞系L78、NCI-H520、A549、LTEP-α-2、NCI-H460和95D中hTERTm

11、RNA均高表達，其中肺巨細胞癌細胞95D相對表達量最高。
　　 (3)有效設計并合成了特異性針對hTERT的siRNA，可以有效下調(diào)肺巨細胞癌細胞95D的端粒酶hTERT mRNA表達，從而抑制端粒酶活性、誘導肺癌細胞凋亡，抑制肺癌細胞增殖。
　　 (4)成功構(gòu)建的hTERT mRNA-siRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進肺癌H1299細胞后，可以有效下調(diào)細胞中hTERT mRNA、蛋白表達，抑制端粒酶活性和肺癌細胞的增殖，改變細胞