Akt2-siRNA對(duì)肺癌細(xì)胞NCI-H446沉默作用的研究.pdf

1、背景和目的 肺癌是目前發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，其病死率居惡性腫瘤的首位，盡管近十年來科學(xué)技術(shù)得到迅猛的發(fā)展，但肺癌患者的總體生存率并無明顯的的改善，其5年生存率不足15％。肺癌目前的治療仍多采用手術(shù)、化療、放療等，生物靶向治療是近年肺癌治療上的突破及研究熱點(diǎn)，靶點(diǎn)藥物目前主要還是針對(duì)非小細(xì)胞肺癌的。隨著分子生物學(xué)研究的不斷進(jìn)展，科學(xué)工作者們?cè)絹碓角宄卣J(rèn)識(shí)到肺癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多基因參與的多步驟的過程，RNAi作為基因治療中

2、一種新的效率高、特異性強(qiáng)的治療手段愈來愈多地受到人們的重視。 RNAi是指由長(zhǎng)約21-23個(gè)核苷酸的雙鏈RNA分子(siRNA,small interferenceRNA)介導(dǎo)的以序列特異的方式抑制同源基因表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄后抑制現(xiàn)象。其作用機(jī)制可概括為：外源或內(nèi)源性dsRNA被Dicer酶切割成21-23nt的雙鏈siRNA(small interference RNA)，雙漣siRNA 與一種蛋白復(fù)合物結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合

3、物RISC(RNA-induced silencing complex)，在解旋酶作用下，由ATP供能，RISC被激活,siRNA解開雙鏈，正義鏈被釋放，反義鏈介導(dǎo)活化的RISC根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則特異性識(shí)別并結(jié)合靶mRNA，切割mRNA，并由核酸外切酶將切割片段徹底降解，從而抑制基因表達(dá)。 Akt是一種編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的基因，因其蛋白質(zhì)產(chǎn)物有與PKA和PKC高度近似的催化結(jié)構(gòu)域，被命名為蛋白激酶B(protein k

4、inase B，PKB)。Akt在上游眾多調(diào)節(jié)因子的作用下對(duì)下游眾多底物產(chǎn)生作用，其下游的眾多底物目前多被證實(shí)為癌基因、抑癌基因、生長(zhǎng)因子、促凋亡因子、促血管生成因子等，故Akt在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、抗藥性、抵抗放射性均發(fā)生著重要作用。AKt2在胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌及肺癌中均有較高的檢出率；我們以Akt2為靶點(diǎn)，利用RNAi技術(shù)使該基因顯示出沉默效應(yīng)，為進(jìn)一步探討該基因功能及肺癌治療新方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法利用GenBank中已知AKT

5、2的mRNA基因序列(M95936)，經(jīng)Blast篩選，設(shè)計(jì)并合成具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的siRNA，將構(gòu)建的基因片段與克隆載體pGEM-TEasy連接，利用藍(lán)白篩選和T7/SP6 PCR擴(kuò)增篩選鑒定重組子pGEM-T-Akt2，對(duì)插入序列進(jìn)行DNA序列分析；用BamHI和XhoI雙酶切重組子pGEM-T-Akt2和siRNA表達(dá)載體pRNAT-U6．2；將雙粘Akt2發(fā)卡樣siRNA片段亞克隆入線化的siRNA表達(dá)載體pRNAT-U6．2中；利

6、用PCR法篩選鑒定重組子pRNAT-U6．2-Akt2；將siRNA表達(dá)載體pRNAT-U6．2-Akt2轉(zhuǎn)染入人肺癌細(xì)胞系NCI-H446細(xì)胞中，用G418培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，RT-PCR檢測(cè)AKT2-mRNA沉默效果。 結(jié)果 1．利用GenBank中已知AKT2的mRNA基因序列(M95936)，經(jīng)Blast篩選，最后確定19個(gè)序列的編碼堿基GGTGTCTGTCATCAAAGAA(即96-114n

7、t)。 2．siRNA發(fā)卡DNA退火后，電泳可見明亮條帶位于約70bp處，與設(shè)計(jì)完全一致。 3．退火產(chǎn)物與pGEM-T Easy連接后，轉(zhuǎn)化JM109，篩選鑒定后得到重組子pGEM-T-Akt2，鑒定結(jié)果與預(yù)期完全一致。 4．pGEM-T-Akt2重組體篩選鑒定后DNA測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)完全一致。 5．亞克隆后，用BamHI和XhoI對(duì)重組質(zhì)粒及表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，并連接得到pRNAT-U6．2-Ak

8、t2，利用設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR篩選鑒定，得到陽(yáng)性克隆。 6．轉(zhuǎn)染pRNAT-U6．2-Akt2的實(shí)驗(yàn)組人肺癌細(xì)胞系NCI-H446細(xì)胞中Akt2-mRNA表達(dá)被明顯抑制，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空白對(duì)照組中都存在較高水平的Akt2-mRNA表達(dá)。 結(jié)論 1．成功設(shè)計(jì)并合成出針對(duì)Akt2的具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)siRNA片段。 2．成功構(gòu)建出針對(duì)Akt2的siRNA表達(dá)載體pRNAT-U6．2-Akt2。 3．應(yīng)用