人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞h446snail基因表達(dá)及其在順鉑耐藥中的作用

1、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H446Snail基因表達(dá)及其在順鉑耐藥中的作用況里杉周向東(400038重慶第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院呼吸內(nèi)科)[摘要]目的觀察鋅指轉(zhuǎn)錄因子snail在耐順鉑（cisplatinCDDP）的人小細(xì)胞肺癌(smallcelllungcancerSCLC)H446CDDP細(xì)胞中的表達(dá)情況，探討snail表達(dá)在人SCLC順鉑耐藥中的作用。方法培養(yǎng)H446細(xì)胞系和H446CDDP細(xì)胞系，采用MTT法檢測(cè)H446CDDP的耐藥指數(shù)；分

2、別提取人SCLC順鉑耐藥細(xì)胞H446CDDP及其親代細(xì)胞H446的mRNA及總蛋白，應(yīng)用sybgreen實(shí)時(shí)熒光RTPCR、westernblot方法檢測(cè)snailmRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果H446CDDP細(xì)胞snail蛋白及mRNA表達(dá)水平較H446細(xì)胞顯著性升高。結(jié)論SCLC的順鉑耐藥性可能與snail表達(dá)水平增高有關(guān)。[關(guān)鍵詞]人小細(xì)胞肺癌；順鉑耐藥；snail；realtimeRTPCR；westernblot[中圖法分類號(hào)]

3、R734.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]AExpressionofSnailinhumansmallcelllungcancercellH446itsroleincisplatinresistanceKuangLisha1ZhouXiangdong1(1DepartmentofRespiratyDiseasessouthwestHospitalThirdMilitaryMedicalUniversityChongqing400038China)[Ab

4、stract]ObjectiveweobservedtheexpressionofzincfingertranionfactSnailinthehumancisplatinresistancesmallcelllungcancer(SCLC)celllineH446CDDPsoastostudyitsroleinhumanSCLCcisplatinresistance.MethodsH446H446CDDPcelllineswereCu

5、lturedcisplatinresistanceindexesweremeasuredbymethyltetrazolium(MTT)assay.mRNAtotalproteinarerespectivelyextractedfromH446H446CDDP.ExpressionlevelofsnailinmRNAproteinlevelwasdetectedbyrealtimeRTPCRwesternblot.ResultsThes

6、nailexpressionofH446CDDPcellsweresignificantlyhigherthanH446cellsbothinproteinmRNAlevel.ConclusionTheciaplatinresistanceinhumanSCLCmayberelevanttothehighexpressionlevelofsnail.[Keywds]humansmallcelllungcancercisplatinres

7、istancesnail；realtimeRTPCR；westernblotSupptedbytheNationalBasicResearchProgramofChina(973Program，2010CB529402)Crespondingauth:ZhouXiangdongEmail:xiangdongzhou@SCLC易發(fā)生順鉑耐藥，其機(jī)制目前尚不完全清楚，可能與凋亡、DNA修復(fù)異常、細(xì)胞內(nèi)藥物異常積累等多種因素相關(guān)[1]。Sna

8、il(鋅指轉(zhuǎn)錄因子)是一種抑制型轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)直接抑制鈣黏蛋白E(Ecadherin)的表達(dá)觸發(fā)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialtomesenchymaltransitionEMT)的發(fā)生，進(jìn)而賦予上皮源性腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲能力[23]。在肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的研究中發(fā)現(xiàn)沉默Snail的表達(dá)能夠恢復(fù)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[45]，而在SCLC尚缺乏相關(guān)方面的研究。因此，本研究擬從EMT的關(guān)鍵因子snail入手研究人SCLC順鉑耐藥性的獲

9、得與snail表達(dá)水平之間的關(guān)系為逆轉(zhuǎn)其耐藥尋求新的途徑。[基金項(xiàng)目]國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃，2010CB529402）[通信作者]周向東Emai:xiangdongzhou@1材料與方法1.1細(xì)胞株及主要試劑人SCLC細(xì)胞系H446（簡(jiǎn)稱H446）及人耐CDDP的SCLC細(xì)胞系H446CDDP（簡(jiǎn)稱H446CDDP）由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院呼吸內(nèi)科保存，培養(yǎng)基RPMI1640購(gòu)于美國(guó)HyClone公司胎牛血清(FBS)購(gòu)于

10、浙江四季青公司；Trizol試劑購(gòu)于天根生化；RealtimeRTPCR試劑盒購(gòu)于康為試劑；引物由上海生工公司合成。1.2細(xì)胞培養(yǎng)H446及H446CDDP細(xì)胞常規(guī)接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2的培養(yǎng)箱在37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞均選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的310代內(nèi)細(xì)胞；為了保持耐藥細(xì)胞的耐藥性，H446CDDP細(xì)胞培養(yǎng)基中同時(shí)加入終濃度為0.5μgml的順鉑維持培養(yǎng)。1.3MTT比色法測(cè)定

11、H446和H446CDDP的細(xì)胞增殖曲線，計(jì)算H446CDDP的順鉑耐藥指數(shù)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H446和H446CDDP細(xì)胞按a：P0.01vsH446組圖3H446和H446CDDP細(xì)胞基因組snailwesternblot結(jié)果3討論肺癌細(xì)胞化療耐藥性的機(jī)制十分復(fù)雜，近年來(lái)，EMT在腫瘤化療耐藥中的作用逐漸為研究者所重視。在多種腫瘤細(xì)胞中的研究顯示：EMT與腫瘤多藥耐藥有密切的聯(lián)系。耐奧沙利鉑的結(jié)腸癌細(xì)胞顯示出許多EMT特征，包括遷移

12、和浸潤(rùn)能力的增加以及向梭狀細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞極性喪失、偽足形成等。在多藥耐藥的卵巢癌細(xì)胞系中能夠觀察到snail、slug的表達(dá)上調(diào)[6]。多藥耐藥的胰腺癌細(xì)胞株中ZEB1表達(dá)增加、Ecadherin表達(dá)減少，抑制ZEB1表達(dá)則上調(diào)細(xì)胞對(duì)藥物敏感性[7]。這些研究均提示：EMT是促進(jìn)腫瘤耐藥的因素之一。Snail是EMT中的主要調(diào)節(jié)蛋白，是含有鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合蛋白。Snail能夠通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)抑制Ecadherin基因的表達(dá)，引起上皮

13、細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致EMT[8]。在EMT與耐藥關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)：敲除snai則能促使A2780卵巢癌耐順鉑細(xì)胞株恢復(fù)對(duì)順鉑的敏感性[9]。乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)snail的表達(dá)促使細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥[10]。提示snail與耐藥密切相關(guān)。WenleiZhuo等研究發(fā)現(xiàn)：敲除Snail能夠通過(guò)促進(jìn)juk線粒體凋亡途徑促使肺腺癌A549細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性增強(qiáng)[5]，提示snail及EMT誘導(dǎo)耐藥的機(jī)制可能與凋亡途徑相關(guān)。SCLC發(fā)生于肺支氣

14、管上皮，是一種具有未分化和神經(jīng)內(nèi)分泌分化的高度惡性腫瘤。除易發(fā)生骨、腦、淋巴結(jié)、肝等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移外，極易發(fā)生多藥耐藥，這使SCLC成為預(yù)后最差的肺癌類型。有研究顯示：ZEB1在SCLC骨轉(zhuǎn)移中具有重要的作用[11]，小鼠移植瘤中的SCLC具有明顯間質(zhì)化的特征[12]，提示SCLC具備EMT的特性，而目前在SCLC中尚缺乏針對(duì)EMT與耐藥相關(guān)性的研究。我們的研究通過(guò)realtimereversetranionPCR和westernblot技術(shù)

15、檢測(cè)H446和H446CDDP細(xì)胞系中SnailmRNA及蛋白表達(dá)水平，比較兩株細(xì)胞系中Snail表達(dá)的不同。結(jié)果顯示：H446CDDP中snail的表達(dá)較H446顯著性升高，這與之前其他腫瘤細(xì)胞系研究結(jié)果相似，說(shuō)明SCLC對(duì)CDDP的耐藥性可能與細(xì)胞高表達(dá)Snail有關(guān)。并且，Snail作為EMT中的主要調(diào)節(jié)蛋白，其在H446CDDP中表達(dá)增高也進(jìn)一步提示SCLC中EMT可能與腫瘤耐藥的發(fā)生密切相關(guān)，可能是化療耐藥的促進(jìn)因子。深入研究

16、人SCLC中Snail基因表達(dá)與順鉑耐藥的關(guān)系，將為SCLC的治療提供新的思路。參考文獻(xiàn)：[1]BrownR.R.GlasspoolEpigeicmodulationofresistancetochemotherapyAnnOncol2007.18(9):p.142930.[2]GuarinoM.B.RubinoG.BallabioTheroleofepithelialmesenchymaltransitionincancerpatho

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