Akt2-siRNA對人肺腺癌A549細(xì)胞的影響.pdf

1、【背景和目的】
　　癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病之一。肺癌是原發(fā)于肺部的腫瘤,近年來,隨著吸煙和各種環(huán)境因素的影響,肺癌成為當(dāng)今世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一,且50％以上的肺癌臨床診斷已屬晚期。盡管目前的手術(shù)治療、放射治療及化學(xué)治療取得了一定的進(jìn)展,但肺癌患者的生存率并無明顯改善。
　　因此,迫切需要尋求新的診斷指標(biāo)和有效的治療方法。隨著分子生物學(xué)研究的不斷進(jìn)展,RNA干擾作為一種新的、強(qiáng)有力的研究工具,在探

2、討基因功能和治療人類疾病方面有著廣闊的前景。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞后引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(posttranscriptional gene silencing,PTGS)。dsRNA經(jīng)核苷酸酶降解為長約21-23個核苷酸的小片段RNA,即小干擾RNA(small interference RNA,siRNA),

3、并以其為模板,特異性降解與該段RNA同源的信使RNA(messenger RNA,mRNA),從而抑制基因的表達(dá)。Akt即絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,因其具有與蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)同源的序列,又被命名為蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)。Akt是細(xì)胞體內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點,為3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositid

4、e3-kinase,PI3K)下游的靶蛋白。
　　在大量的人類腫瘤中可以發(fā)現(xiàn)Akt信號通路的激活,且Akt的活化與腫瘤的預(yù)后有關(guān)。Akt的下游底物參與了蛋白合成、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡等重要的生物學(xué)功能,使得Akt成為腫瘤干預(yù)治療的重要靶點。Akt有三種亞型:即Akt1、Akt2和Akt3。針對Akt及其亞型的功能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)三個Akt亞型均參與下游底物的活化,其中以Akt2為主。Akt2在胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌及肺癌中均有較高的檢出

5、率。我們以Akt2為靶點,利用Akt2基因特異性siRNA,運(yùn)用RNA干擾技術(shù),觀察其對人肺腺癌細(xì)胞A549中Akt2蛋白激酶表達(dá)是否具有抑制作用,對于腫瘤細(xì)胞的化療藥物敏感性是否產(chǎn)生影響,為進(jìn)一步探討該基因功能及肺癌治療新方法提供實驗基礎(chǔ)。
　　【方法】
　　將構(gòu)建好的siRNA載體通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞,篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,將A549細(xì)胞分為siRNA干擾組,無關(guān)siRNA對照組和未轉(zhuǎn)染空白組,RT-

6、PCR法檢測各組細(xì)胞Akt2的mRNA含量,用western blot法測定各組細(xì)胞的Akt2蛋白濃度,流式細(xì)胞術(shù)檢測Akt2-siRNA干擾、紫杉醇應(yīng)用對A549細(xì)胞的凋亡的影響。
　　【結(jié)果】
　　1.轉(zhuǎn)染Akt2-siRNA的A549細(xì)胞的Akt2 mRNA的表達(dá)量明顯低于空載體陰性對照組及未處理的A549細(xì)胞組,經(jīng)過灰度掃描及統(tǒng)計學(xué)分析,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.提取穩(wěn)定表達(dá)Akt2-siR

7、NA、空載體干擾的A549細(xì)胞和未處理的A549細(xì)胞的總蛋白,經(jīng)Western blot檢測,表明轉(zhuǎn)入Akt2-siRNA基因的Akt2蛋白的表達(dá)量明顯低于空載體陰性對照組及未處理的A549細(xì)胞組,經(jīng)過灰度掃描及統(tǒng)計學(xué)分析,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.Akt2-siRNA轉(zhuǎn)染和紫杉醇作用48h均能明顯促進(jìn)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡,并且紫杉醇誘導(dǎo)組A549細(xì)胞發(fā)生凋亡的效果明顯強(qiáng)于Akt2-siRNA轉(zhuǎn)染組,然而如果將

8、穩(wěn)定表達(dá)Akt2-siRNA的細(xì)胞株利用紫杉醇作用48h后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Akt2-siRNA聯(lián)合紫杉醇誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)。
　　【結(jié)論】
　　1.Akt2-siRNA能明顯下調(diào)人肺腺癌A549細(xì)胞的Akt2 mRNA的表達(dá)量。
　　2.Akt2-siRNA能明顯下調(diào)人肺腺癌A549細(xì)胞的Akt2蛋白的表達(dá)。
　　3.Akt2-siRNA能明顯誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡,聯(lián)合紫杉醇其誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的