不同IL-15基因轉(zhuǎn)染對(duì)NCI-H446腫瘤細(xì)胞增殖及周期調(diào)控分子表達(dá)的影響.pdf

1、目的 腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命健康的重大疾病；轉(zhuǎn)染抗瘤相關(guān)細(xì)胞因子基因，是探索腫瘤基因治療的重要領(lǐng)域。白細(xì)胞介素15(IL-15)是1994年發(fā)現(xiàn)的與IL-2有類似生物活性的細(xì)胞因子，可促進(jìn)NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞增殖并提高它們殺瘤活性。人體許多組織細(xì)胞都有IL-15mRNA 表達(dá)但少有IL-15蛋白分泌，提示IL-15 體內(nèi)正常作用有可能主要是在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮。已有報(bào)道將原型IL-15 基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)，并未獲得理想的高效

2、抗瘤效果，推測(cè)可能與原型IL-15 基因自身長(zhǎng)信號(hào)肽抑制其蛋白分泌有關(guān)。但轉(zhuǎn)染能促進(jìn)蛋白分泌的改型IL-15 基因，也未取得預(yù)期效果。 我們先前發(fā)現(xiàn)不同IL-15 基因轉(zhuǎn)染人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446 腫瘤細(xì)胞，可明顯降低其細(xì)胞的增殖速率，只是降低的程度彼此不盡一致。腫瘤細(xì)胞是由正常細(xì)胞突變而來，與其來源的正常組織細(xì)胞相比，細(xì)胞周期失控增殖速率加快是其主要惡性特征之一。迄今發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)影響細(xì)胞增殖速率的相關(guān)分子主要有：細(xì)胞

3、周期正調(diào)控分子細(xì)胞周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依賴性激酶(CDK)及細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控分子CDK抑制蛋白(CDKI)和某些抑癌基因編碼蛋白。 本研究用本室已成功構(gòu)建的3種轉(zhuǎn)染不同形式IL-15 基因的NCI-H446細(xì)胞模型(轉(zhuǎn)染原型IL-15基因的C<,IL-15>、轉(zhuǎn)染IL-15 成熟肽基因的C<,IL-15mp>和轉(zhuǎn)染以IL-2 信號(hào)肽替代IL-15信號(hào)肽的改型IL-15 基因的C<,IL-2sp-15mp>)作實(shí)驗(yàn)組，

4、用野生型NCI-H446 細(xì)胞(Cw)作對(duì)照組，研究不同形式IL-15基因轉(zhuǎn)染對(duì)NCI-H446腫瘤細(xì)胞增殖的影響，以及對(duì)細(xì)胞周期正調(diào)控分子(cyclin D1、cyclin E、CDK2和CDK4)和細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控分子(p21和Rb)的蛋白及mRNA表達(dá)的影響，揭示其分子基礎(chǔ)，為進(jìn)一步探索IL-15基因的抗腫瘤作用提供有益的線索和啟示。 方法 1 以野生株NCI-H446細(xì)胞(Cw)為對(duì)照組，用本室已構(gòu)建的3種分別以不

5、同IL-15基因轉(zhuǎn)染的NCI-H446細(xì)胞模型(原型IL-15基因轉(zhuǎn)染的C<,IL-15>、IL-15成熟肽基因轉(zhuǎn)染的C<,IL-15mp>和以IL-2信號(hào)肽替代IL-15信號(hào)肽的改型IL-15基因轉(zhuǎn)染的C<,IL-2sp-IL-15mp>)為實(shí)驗(yàn)組，臺(tái)盼藍(lán)拒染法在連續(xù)8天的培養(yǎng)中每天計(jì)數(shù)活細(xì)胞，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；MTT法檢測(cè)培養(yǎng)24h、48h、72h和96h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期的變化。 2 以野生株N

6、CI-H446細(xì)胞(C<,w>)為對(duì)照，檢測(cè)3種轉(zhuǎn)染不同IL-15基因的NCI-H446細(xì)胞模型細(xì)胞(C<,IL-15>、C<,IL-15mp>和C<,IL-2sp-IL-15mp>)中，細(xì)胞周期正調(diào)控分子cyclin D1、cyclin E、CDK2和CDK4的蛋白表達(dá)(Western-blot法)和mRNA表達(dá)(RT-PCR法)。 3 以野生株NCI-H446 細(xì)胞(C<,w>)為對(duì)照，檢測(cè)3種轉(zhuǎn)染不同IL-15基因的NCI

7、-H446細(xì)胞模型細(xì)胞(C<,IL-15>、C<,IL-15mp>和C<,IL-2sp-IL-15mp>)中，細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控分子p21和Rb的蛋白表達(dá)(Western-blot法)和mRNA表達(dá)(RT-PCR法)。 結(jié)果 1 不同IL-15基因轉(zhuǎn)染對(duì)NCI-H446腫瘤細(xì)胞增殖的影響 2 不同IL-15基因轉(zhuǎn)染對(duì)NCI-H446腫瘤細(xì)胞周期的影響四種細(xì)胞G0/G1期的比例分別是[(69.44±3.26)％(C<,

8、w>)]，[(73.47±1.49)％(C<,IL-15>)]，[(76.81±1.41)％(C<,IL-15mp>)]和[(81.26±2.31)％(C<,IL-2sp-IL-15mp>)]，彼此間都有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；3種轉(zhuǎn)染IL-15 基因的NCI-H446 細(xì)胞G0/G1期的比例都顯著高于野生株NCI-H446 G0/G1期的比例(P<0.05或P<0.01)。四種細(xì)胞G0/G1 期細(xì)胞比例由高到低，依次

9、為C<,IL-2sp-IL-15mp>、C<,IL-15mp>、C<,IL-15>、C<,w>。 3 不同IL-15基因轉(zhuǎn)染對(duì)NCI-H446腫瘤細(xì)胞周期正調(diào)控分子表達(dá)的影響3.1 cyclin D1的表達(dá)cyclin D1蛋白的表達(dá)分別是0.893±0.182(C<,w>)、0.717±0.148(C<,IL-15>)、0.749±0.172(C<,IL-15mp>) 和0.786±0.172(C<,IL-2sp-IL-15m

10、p>)。與C<,w>相比，3種不同IL-15基因轉(zhuǎn)染的NCI-H446細(xì)胞cyclin D1蛋白表達(dá)均與之無顯著性差異(均P>0.05)；3種不同IL-15基因轉(zhuǎn)染的NCI-H446細(xì)胞間的表達(dá)也均無顯著性差異(均P>0.05)。表明3種不同IL-15基因轉(zhuǎn)染對(duì)NCI-H446細(xì)胞cyclin D1的蛋白表達(dá)無影響。 4 不同IL-15基因轉(zhuǎn)染對(duì)NCI-H446腫瘤細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控分子表達(dá)的影響4.1 p21的表達(dá)p21蛋白的表達(dá)

11、分別是0.907±0.042(C<,w>)、1.052±0.086(C<,IL-15>)、0.848±0.084 (C<,IL-15mp>) 和0.878±0.050 (C<,IL-2sp-IL-15mp>)。與C<,w>相比，C<,IL-15>的p21蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)，C<,IL-15mp>和C<,IL-2sp-IL-15mp>與之無顯著性差異(均P>0.05)。表明原型IL-15基因轉(zhuǎn)染可增加HNCI-H446腫瘤細(xì)胞

12、的p21蛋白表達(dá)；成熟肽基因或改型基因的轉(zhuǎn)染，對(duì)NCI-H446腫瘤細(xì)胞的p21蛋白表達(dá)無顯著影響。 結(jié)論 1 3種不同IL-15基因轉(zhuǎn)染可減慢NCI-H446腫瘤細(xì)胞增殖速率，減慢程度由高至低依次為C<,IL-2sp-IL-15mp>、C<,IL-15mp>、C<,IL-15>；減慢NCI-H446腫瘤細(xì)胞增殖速率與升高G0/G1期比例和降低S期比例有關(guān)。 2 3種不同IL-15基因轉(zhuǎn)染致NCI-H446腫瘤細(xì)