胞漿中TMEM88與Dvls結合促進非小細胞肺癌的侵襲轉移.pdf

1、目的：
　　選擇了多種人類上皮性惡性腫瘤，對TMEM88的蛋白表達和定位進行了檢測，尤其是篩選了TMEM88分別表達于細胞膜和細胞漿中的肺癌細胞系，并通過雙向調控TMEM88和Dvl的表達，探討其與Dvl之間的關系以及對肺癌細胞增殖、侵襲能力的影響和可能的作用機制。
　　材料與方法：
　　一、患者信息和樣本
　　214例非小細胞肺癌、29例乳腺導管浸潤癌、35例結腸癌、26例肝癌及24例胃癌標本均來自中國醫(yī)科大學

2、附屬第一臨床醫(yī)院病理科存檔蠟塊。
　　另收集40例新鮮的肺癌組織及相對應的周圍正常的肺組織標本，保存在-70℃冰箱內，用于提取蛋白質和免疫印記檢測TMEM88在肺癌組織的表達情況。
　　二、Western Blot
　　采用RIPA裂解液對組織或細胞進行充分裂解，分別提取其總蛋白，取100微克的總蛋白通過10％濃度的SDS-PAGE進行蛋白電泳，然后轉印到PVDF膜上。5％脫脂奶粉封閉2小時，一抗CyclinD1，Dv

3、l-1，Dvl-2，Dvl-3; TMEM88-N和GAPDH; Snail, Slug, MMP-7,Myc-tag,HA-tag,Vimentin,P38, p-P38, JNK,p-JNK, ERK,p-ERK, GSK3β, p-GSK3β-Ser9,p-GSK3β-Thr390,p-ATF2,ATF2和p-NF-κb-Ser536;β-catenin, E-cadherin, N-cadherin,NF-κB，和C-myc;

4、Claudin-1; Zo-1和Occludin4℃過夜。山羊抗兔和鼠二抗37℃孵育2小時。ECL發(fā)光后，Bio-Image system進行條帶灰度值測定，以與GAPDH的比值作為相對表達量。實驗重復三次取均值。
　　三、免疫組織化學
　　所有的組織均經中性福爾馬林固定，石蠟包埋后，制成4微米厚度的切片。采用S-P免疫組化法進行染色。一抗使用多克隆兔源性的TMEM88-N抗體(1∶100)4度孵育過夜。以PBS代替一抗作為

5、空白對照。生物素標記的二抗(Ultrasensitive;MaiXin，F(xiàn)uzhou，China)37℃孵育30分鐘，DAB顯色。
　　每張切片隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞。根據(jù)計數(shù)細胞著色的百分比，TMEM88的表達被劃分成五個等級:0分（無著色），1分(1-25％)，2分(26-50％)，3分(51-75％)，4分（76％以上）。再根據(jù)細胞著色的強度，TMEM88的表達又被劃分成3個等級:0分（無著色），1分（淺

6、黃色顆粒），2分（深黃色或者黃褐色顆粒）。每一張組織切片都對應一個百分比分數(shù)和著色分數(shù)，將二者相乘，所得的乘積即為該切片的最終得分。
　　由于目前尚沒有公認的TMEM88免疫組化陽性判定標準，根據(jù)我們設定的評分標準對68例癌旁正常的肺組織中支氣管和肺泡上皮染色結果進行判讀后發(fā)現(xiàn)，其得分幾乎都小于4分。據(jù)此，我們將大于或者等于4分的定義為陽性表達，而小于4分者定義為陰性表達。
　　四、Cell lines
　　HBE細胞

7、系從ATCC(Manassas，VA，USA)細胞庫獲得。LK2購買于JCRB細胞庫(Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank),PG-BE1(BE1)和PG-LH7(LH7)是來自北京大學zhengjie教授的友好惠贈，A549、H1299、H460、H157、SPC-A-1(SPC)和LTEP-A-2(LTE)購于上海細胞庫。細胞系均用含10％小牛血清(Invitr

8、ogen，Carlsbad，CA，USA)和100U/mL青鏈霉素(Sigma, St.Louis，MO，USA)的1640培養(yǎng)基(Invitrogen)并置于5％濃度的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　五、質粒構建與轉染
　　pCMV6-ddk1-myc空載體和pCMV6-ddk1-myc-TMEM88購買于Origene公司（Origene Technologies Inc，Rockville，MD，USA），pCS2+MT

9、-mDvl1質粒由羅振革博士（中國科學院上海生命科學院神經科學研究所）惠贈，pMyc-cyto-hDvl3質粒由Schultz教授(Department of Chemistry and The Skaggs institute for ChemicalBiology，CA，USA)惠贈。GSK3β-HA，Super8x TOP Flash和Super8x FOP Flash購買于Addgene公司， Dvl1/3-siRNA(靶序列A

10、ACAAGATCACCTTCTCCGAG)，Dvl2-siRNA(靶序列 TCCACAATGTCTCTCAATA)，由廣州銳博公司合成，TMEM88-siRNA(sc-93891), NC-siRNA(sc-37007), Snail-siRNA(sc-38398)購于Santa Cruz公司，TMEM88-shRNA和NC-shRNA由上海吉瑪公司合成。采用Lipofectamine2000(invitrogen，Carlsbad，C

11、A USA)對細胞進行瞬時轉染。
　　六、通過上述準備進行免疫熒光實驗、MTT實驗、基質膠侵襲實驗、劃痕實驗、免疫共沉淀實驗等實驗，并進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：
　　一、細胞漿中TMEM88的高表達與肺癌不良預后相關
　　TMEM88在正常支氣管上皮中陰性表達，在肺癌組織中明顯高表達，且定位于細胞漿中，偶見膜表達和核表達。TMEM88的高表達與肺癌的低分化、高TNM分期和淋巴結轉移及不良預后相關。TMEM88在

12、乳腺癌等惡性上皮腫瘤中明顯高表達，同樣定位于細胞漿.在肺癌細胞系中，TMEM88僅在LK2中定位于細胞膜，在其他細胞中定位于細胞漿。
　　二、在膜表達細胞系中TMEM88抑制經典Wnt信號通路而在胞漿表達細胞系中的則不能
　　在膜表達細胞(LK2)中，轉染TMEM88抑制經典Wnt活性，及其下游靶基因MMP-7、CyclinD1和C-myc的表達，但轉染TMEM88-△C后則對Wnt信號通路活性和其下游靶基因的表達均無抑制效

13、應。在TMEM88漿表達的細胞（A549和H1299）中分別轉染TMEM88和TMEM88-△C，或在H1299和SPC細胞中轉染TMEM88-siRNA后，對經典Wnt通路活性和其靶基因的表達均沒有明顯影響
　　三、無論在膜或漿表達的細胞系中， TMEM88均能與Dvl結合
　　免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn):二者在LK2細胞的胞膜上和H1299細胞的胞漿中存在著共定位，經免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)在兩種細胞中，TMEM88與Dvls存在著相互作用

14、，尤其是與Dvl-1，3亞型的相互作用較強，而與Dvl-2的結合較弱而轉染TMEM88-△C時二者相互作用明顯減弱且在膜上或漿中的共定位現(xiàn)象消失。提示TMEM88與Dvls的結合依賴其完整的C端結構。
　　四、 TMEM88的不同定位對癌細胞的增殖和侵襲作用不同
　　轉染TMEM88后LK2（TMEM88定位于膜）細胞的增殖、遷移和轉移能力明顯被抑制。而在H1299和SPC（TMEM88定位于漿）細胞中雙向調節(jié)TMEM88的

15、表達并不影響其增殖能力，但過表達TMEM88可以促進其遷移和轉移能力，而干擾TMEM88的表達可以抑制其遷移和轉移能力。
　　結論：
　　1、TMEM88在肺癌細胞漿中高表達，與肺癌的惡性表型明顯相關。
　　2、在膜表達細胞中，TMEM88抑制Wnt信號，在胞漿表達細胞中對Wnt無影響。
　　3、TMEM88與Dvl在LK2中共定位于細胞膜，在H1299中共定位于細胞漿。
　　4、在膜表達細胞中，TMEM8