Tmem88在肝星狀細(xì)胞中的重要作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、肝纖維化（hepatic fibrosis, HF）是一種由多種致肝損傷的因子（例如：HBV或HCV感染、酒精濫用、高脂飲食等）引起的損傷修復(fù)反應(yīng)。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell, HSC)的活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，抑制肝星狀細(xì)胞的活化及增殖是肝纖維治療的主要策略之一。Wnt/β-catenin通路的激活不僅是肝星狀細(xì)胞活化的重要標(biāo)志，并且能夠顯著地促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化和增殖。跨膜蛋白88(Transm

2、embrane protein88，Tmem88)是一種雙跨膜的蛋白，在人心肌細(xì)胞以及非洲爪蟾的胚胎細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)其能夠抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化。Tmem88能否通過阻礙Wnt/β-catenin通路的活化來抑制肝星狀細(xì)胞的活化與增殖，從而阻礙肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，還未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　為研究Tmem88在肝纖維化進(jìn)程中的作用，課題組檢測(cè)Tmem88在人肝纖維化組織、小鼠原代肝星狀細(xì)胞以及活化的HSC-T6細(xì)胞

3、中的表達(dá)變化；通過分別過表達(dá)和沉默HSC-T6細(xì)胞中的Tmem88，檢測(cè)Tmem88對(duì)于肝星狀細(xì)胞的活化、增殖及凋亡的影響；通過檢測(cè)Tmem88基因的甲基化狀態(tài)，探討其表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，并進(jìn)一步探究了3種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶對(duì)其表達(dá)的調(diào)控作用。本文主要研究內(nèi)容包括下面4個(gè)部分：
　　1. Tmem88在人肝纖維化組織、小鼠原代肝星狀細(xì)胞以及活化的HSC-T6細(xì)胞中的表達(dá)變化
　　臨床標(biāo)本：從臨床收集新鮮的人肝癌組織，HE和Mas

4、son染色觀察肝臟病理改變，根據(jù)病理分級(jí)，將肝組織分為對(duì)照組（Control）和纖維化組（Fibrosis）。分別提取肝纖維化組織以及對(duì)照組肝組織，應(yīng)用Western Blot、免疫組化技術(shù)檢測(cè)Tmem88的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：Tmem88在人肝纖維組織中的表達(dá)顯著降低。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將24只C57BL/6小鼠（雄性，20~22g）隨機(jī)分為對(duì)照組（Control）和肝纖維化模型組（CCL4），每組12只。模型組小鼠背部皮下注射2

5、0%CCL4橄欖油溶液，每周2次，持續(xù)4周；對(duì)照組給予相同劑量的橄欖油溶液。停止注射CCL4后的第二天分別處死對(duì)照組和模型組中的小鼠，收集血清、肝臟標(biāo)本以及原代的肝星狀細(xì)胞待用。H&E染色和Masson染色觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)的病理變化，生化指標(biāo)檢測(cè)血清ALT和AST水平。免疫熒光雙染、免疫組化、QPCR以及Western Blot檢測(cè)Tmem88的定位和表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）小鼠肝纖維化模型建立成功；（2）Tmem88主要表達(dá)于小鼠的

6、肝星狀細(xì)胞中；（3）Tmem88在肝纖維化小鼠的原代肝星狀細(xì)胞中表達(dá)下降。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：HSC-T6細(xì)胞經(jīng)10ng/ml的TGF-β1刺激活化24h后，分別采用QPCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)Tmem88在活化的HSC中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：Tmem88在TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC-T6細(xì)胞中表達(dá)顯著降低。
　　2.過表達(dá)Tmem88對(duì)HSC-T6細(xì)胞活化、增殖以及凋亡的影響
　　應(yīng)用QPCR和Weste

7、rn Blot技術(shù)檢測(cè)HSC-T6中活化標(biāo)志蛋白（Col1α1和α-SMA）的表達(dá)變化，明確過表達(dá)Tmem88對(duì)HSC-T6細(xì)胞活化的影響；其次運(yùn)用MTT檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞的細(xì)胞活力變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，明確過表達(dá)Tmem88對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)過表達(dá)Tmem88對(duì)HSC-T6細(xì)胞中的Wnt/β-catenin活化的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的分布，Western Blo

8、t技術(shù)檢測(cè)HSC-T6中凋亡相關(guān)蛋白（Caspase3、Bcl-2和Bax）的表達(dá)變化，明確過表達(dá)Tmem88對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)Tmem88可以逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞活化，通過阻礙Wnt/β-catenin通路活化能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6的增殖并使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并且能夠促進(jìn)活化的HSC-T6細(xì)胞的凋亡。
　　3.沉默Tmem88對(duì)HSC-T6細(xì)胞活化、增殖以及

9、凋亡的影響
　　應(yīng)用QPCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)HSC-T6中活化標(biāo)志蛋白（Col1α1和α-SMA）的表達(dá)變化，明確沉默Tmem88對(duì)HSC-T6細(xì)胞活化的影響；應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)沉默Tmem88對(duì)HSC-T6細(xì)胞中的Wnt/β-catenin通路活化的影響；應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)HSC-T6中凋亡相關(guān)蛋白（Caspase3、Bcl-2和Bax）的表達(dá)變化，明確沉默Tmem88對(duì)HS

10、C-T6細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：沉默Tmem88可以促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞活化，強(qiáng)化Wnt/β-catenin通路的活化，并且能夠抑制活化的HSC-T6細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　4. DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶對(duì)Tmem88表達(dá)的影響
　　RRBS篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tmem88基因的甲基化程度在肝纖維化小鼠的原代肝星狀細(xì)胞中是正常對(duì)照小鼠的158倍。在卵巢癌的研究中也發(fā)現(xiàn)Tmem88的蛋白表達(dá)與其基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲

11、基化狀態(tài)相關(guān)。課題組進(jìn)一步觀察了Tmem88的甲基化調(diào)控機(jī)制。課題組應(yīng)用了DNA甲基化抑制劑5-AzadC（2umol/L）處理TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC-T6細(xì)胞，應(yīng)用Western Blot技術(shù)分別檢測(cè)Tmem88以及活化標(biāo)志蛋白（Col1α1和α-SMA）的表達(dá)變化；提取小鼠原代肝星狀細(xì)胞以及活化的HSC-T6細(xì)胞中的蛋白，應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)三種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b）的表達(dá)