小鼠肝星狀細胞旁分泌機制在急性肝損傷再生修復中的作用.pdf

1、急肝衰竭全球發(fā)病率較高，病情兇險，預后較差，內科藥物治療病死率高；由于供肝缺乏及免疫排斥問題臨床上僅約10％的患者實施了肝移植；肝細胞移植治療和生物型人工肝輔助系統(tǒng)的應用也由于種子細胞來源缺乏和細胞移植后增殖效率低下而受到限制。因此急性肝衰竭的治療一直是臨床上亟待解決的難題。干細胞生存微環(huán)境(stem cell niche)是干細胞生活的特定環(huán)境，維持并調節(jié)干細胞的生物學特性，使之在靜息態(tài)、自我更新和分化上保持平衡。深入研究肝臟干細胞n

2、iche的結構與功能將充分激發(fā)內源性肝臟干細胞在肝臟再生中的修復潛能。這種方法不需要外源性的供體，也不存在免疫排斥的問題，是肝損傷疾病治療的理想方法。肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)作為肝臟干細胞niche中重要的支持細胞在肝臟再生中的作用及機制尚未闡明。本研究首先明確了活化的HSCs在急性肝損傷再生修復中的作用；接著建立了小鼠肝星狀細胞分離純化和體外培養(yǎng)模型，并觀察不同活化階段HSCs的生物學特性；

3、最后探明活化的HSCs旁分泌途徑是否參與急性肝損傷再生修復的過程并闡述相關作用機制。
　　第一部分小鼠肝星狀細胞活化不良對急性肝損傷再生修復的影響
　　目的：明確活化的小鼠肝星狀細胞(mouse hepatic stellate cells，m-HSCs)在急性肝損傷時是否具有促進肝細胞有絲分裂和/或肝臟干細胞增殖的作用。
　　方法：在對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)誘導的化學性急性肝損傷小鼠模型基

4、礎上，通過連續(xù)腹腔注射膠毒霉素(gliotoxin，1mg/kg體重)消除肝內活化的星狀細胞，建立肝星狀細胞活化不良(loss of function)模型。通過細胞毒性實驗，觀察gliotoxin對肝細胞和Kupffer細胞的影響。并利用該模型，從小鼠血清轉氨酶濃度、生存分析、肝細胞壞死及凋亡程度、CD45陽性淋巴細胞浸潤程度、肝細胞和卵圓細胞增殖能力等方面評估活化的HSCs在肝急性損傷再生修復中的作用。
　　結果：膠毒霉素的肝

5、細胞毒性實驗顯示，膠毒霉素(3mg/kg體重)單次腹腔注射后，與對照組相比，在血清轉氨酶ALT、AST。的濃度、肝損傷組織學評分、肝細胞增殖能力方面均無明顯差異(P>0.05)。m-HSCs活化不良模型中發(fā)現(xiàn)，Gliotoxin組活化的HSCs(α-SMA+-HSCs)數(shù)目為(13.13±2.92)/FOV，較對照組(130.12±20.44)/FOV下降90％，存在顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。碳顆粒吞噬實驗顯示，兩組小鼠肝內碳顆粒

6、陽性Kupffer細胞的數(shù)目無明顯差異(P>0.05)。Gliotoxin組與對照組相比，血清轉氨酶ALT、AST的濃度分別升高73％(P<0.05)和72％(P<0.01)，具有統(tǒng)計學差異。生存分析提示，Gliotoxin組小鼠5天生存率明顯下降為55％，對照組為89％，兩組間具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。Gliotoxin組與對照組相比，肝損傷組織學評分分別為(2.41±0.52)和(3.43±0.74)，兩組間具有統(tǒng)計學差異(P

7、<0.01)；CD45陽性淋巴細胞數(shù)目分別為(146.49±52.87)/FOV和(99.06±26.35)/FOV，兩組間具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；凋亡的肝細胞數(shù)目分別為(16.94±9.33)/FOV和(4.29±3.06)/FOV，兩組間具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；BrdU陽性肝細胞的數(shù)目減少66％，分別為(3.83±1.92)/FOV和(11.29±5.21)/FOV，兩組間具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，同時5個肝細

8、胞增殖相關基因的表達程度出現(xiàn)不同程度下降，為(0.2～4.3)倍；其中OSM、EGF、IL6基因的表達水平明顯下降，兩組間具有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.01)，HGF、SCF基因的表達水平也出現(xiàn)下降，兩組間具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；肝內PanK陽性卵圓細胞(Oval cell，OVc)的數(shù)目分別為(7.64±4.03)/FOV和(8.54±4.14)/FOV，兩組間具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，同時Gliotoxin組CK19基因

9、的表達程度明顯下降(P<0.05)。
　　結論：肝星狀細胞活化不良加重APAP誘導的急性肝損傷；肝星狀細胞活化不良同時導致肝細胞有絲分裂能力下降和卵圓細胞增殖能力下降。
　　第二部分小鼠肝星狀細胞分離純化和體外培養(yǎng)模型的建立
　　目的：建立小鼠肝星狀細胞分離純化的高效穩(wěn)定方案，并通過原代和傳代培養(yǎng)觀察其生物學特性的變化。
　　方法：采用二氯亞甲基二膦酸脂質體(CL2MDP-liposome)腹腔注射(10ml/k

10、g體重)預處理小鼠，三天后依次應用預灌注液、0.1％Pronase E、0.075％CollagenaseNB4G對在體肝臟原位灌注消化。肝臟離體后，在0.02％DNaseⅠ液中磁力攪拌消化10min，低速離心(25g，5min)去除殘余肝實質細胞，進一步用Optiprep密度梯度液獲得純化的m-HSCs。采用碳顆粒吞噬實驗檢測Kupffer細胞的吞噬功能；臺盼藍染色法評估細胞得率及活率；采用自發(fā)熒光及油紅O染色鑒定細胞純度；采用光鏡、

11、電鏡以及Desmin/α-SMA免疫熒光雙染色觀察不同培養(yǎng)階段HSCs的細胞形態(tài)和生物學特征。
　　結果：C57BL/6小鼠24只，體重(22.47±1.13)g，肝重(1.30±0.14)g，肝重和體重比為1:17.28。CL2MDP-liposome預處理后的小鼠分離得到的原代m-HSCs數(shù)量為(1.62±0.34)×106/g肝臟，細胞純度為(94.44±1.89)％，細胞活率為(94.41±1.50)％；PBS-lipos

12、ome組m-HSCs的細胞得率為(1.37±0.23)×106/g肝臟，細胞純度為(90.18±1.61)％，細胞活率為(94.51±1.61)％。CL2MDP-liposome組m-HSCs在細胞得率和細胞純度方面均優(yōu)于PBS-liposome組(P<0.05/P<0.01)；兩組間細胞活率無明顯差異(P>0.05)，兩組細胞經(jīng)第一次傳代培養(yǎng)后細胞純度均接近100％。靜止期和不同活化階段的m-HSCs在亞顯微結構以及α-SMA表達強度

13、方面存在差異。
　　結論：二氯亞甲基二膦酸脂質體能選擇性清除肝內Kupffer細胞，并提高m-HSCs分離的細胞得率和細胞純度；通過改良在體肝臟灌注消化過程，優(yōu)化密度梯度離心技術，成功建立了高效穩(wěn)定的m-HSCs分離純化及體外培養(yǎng)模型；早期活化階段和完全活化階段的m-HSCs在細胞表型和亞細胞結構方面存在差異性。
　　第三部分小鼠肝星狀細胞旁分泌因子在急性肝損傷再生修復中的作用
　　目的：明確活化的HSCs旁分泌因子在

14、急性肝損傷再生修復中的作用及機制。方法采用原代培養(yǎng)第5天和傳代培養(yǎng)第三代的HSCs分別制備成早期活化階段和完全活化階段的HSCs旁分泌因子，應用蛋白芯片進行蛋白成分差異性分析；分別將早期活化階段和完全活化階段的HSCs旁分泌因子通過小鼠尾靜脈進行體內移植，觀察兩者對APAP(750mg/kg體重)誘導的急性肝衰竭的治療作用，并從促進細胞增殖、抗細胞壞死及凋亡、調節(jié)炎癥反應水平三方面評估HSCs旁分泌因子的作用及機制；采用早期活化的HSC

15、s旁分泌因子作為條件培養(yǎng)基在體外與肝細胞進行培養(yǎng)，從抗APAP誘導的肝細胞損傷、促細胞增殖及代謝功能方面評估其作用；進一步分離培養(yǎng)小鼠成體肝臟干細胞(adult hepatic progenitor cell，AHPC)，將早期活化的HSCs旁分泌因子作為條件培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，觀察其對AHPC增殖及代謝能力的影響。
　　結果：
　　體內實驗：與HSC-CM(P3)組、對照組小鼠相比，HSC-CM(5d)組小鼠血清ALT濃度分別

16、下降42％和46％：AST濃度分別下降42％和45％；均存在統(tǒng)計學差異(P<0.01)；HSC-CM(P3)組與對照組相比，無明顯統(tǒng)計學差異。急性肝損傷組織學評分，提示HSC-CM(5d)組、HSC-CM(P3)組和對照組的評分分別為(2.25±0.45)、(3.51±0.57)和(3.75±0.51)；HSC-CM(5d)組的評分低于HSC-CM(P3)組和對照組，均存在統(tǒng)計學差異(P<0.01/P<0.05)。HSC-CM(P3)組

17、和對照組相比，無統(tǒng)計學差異。生存分析提示，HSC-CM(5d)組小鼠5天生存率為85％；HSC-CM(P3)組為51％；對照組(Vehicle)為42％，HSC-CM(5d)組生存率明顯優(yōu)于對照組，兩組間存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)；HSC-CM(5d)組與HSC-CM(P3)組相比以及HSC-CM(P3)組與對照組相比均無統(tǒng)計學差異。進一步以HSC-CM(5d)為對象進行重點研究，經(jīng)過尾靜脈移植后，HSC-CM(5d)組和對照組肝內

18、CD45陽性的淋巴細胞數(shù)分別為(45.58±28.72)/FOV和(125.20±54.05)/FOV，兩組之間存在顯著差異(P<0.01)。全身炎癥反應水平方面，與對照組相比，HSC-CM(5d)組小鼠血清IL6濃度無明顯下降；而前炎癥細胞因子IFNγ、IL1ra、IL1β的濃度均出現(xiàn)不同程度的下降，兩組間存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)；TNFα下降68％，兩組間存在顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)；抗炎細胞因子IL10的濃度明顯升高(

19、P<0.05)，是對照組的1.9倍。肝細胞凋亡方面，HSC-CM(5d)組肝內TUNEL陽性的肝細胞核數(shù)為(3.93±1.77)/FOV，與對照組的(23.52±4.02)/FOV相比，減少83％，兩組之間存在顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。肝細胞有絲分裂方面，對照組肝內BrdU陽性的肝細胞核數(shù)為(5.05±3.14)/FOV；與之相比，HSC-CM(5d)組增多2倍，為(15.60±7.19)/FOV，兩組之間存在顯著統(tǒng)計學差異(P<

20、0.01)；進一步從基因水平驗證，提示與對照組相比，HSC-CM(5d)組肝內5個肝細胞增殖相關基因(OSM、IL6、HGF、EGF、SCF)的表達水平均發(fā)生不同程度的上調，升高幅度約為(2～32)倍。肝臟干細胞增殖方面，對照組肝內PanK陽性的OVc數(shù)為(7.26±2.56)/FOV；與之相比，HSC-CM(5d)組為(8.97±3.75)/FOV，兩組之間存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。進一步行RT-PCR提示，HSC-CM(5d)

21、組肝組織內CK19和EpCAM基因的表達水平均發(fā)生上調，兩組間存在統(tǒng)計學差異(P<0.01/P<0.05)。蛋白芯片：進行蛋白成分差異性分析提示，早期活化和完全活化的HSCs旁分泌因子共同表達所檢測的144種細胞因子中的69種。兩者整體構成相似，均主要由細胞趨化因子、細胞素、細胞生長因子、結合蛋白、細胞外間質修復相關因子等構成。對69種細胞因子進行組間比較，發(fā)現(xiàn)濃度相差2倍以上的細胞因子共7種，分別為單核細胞趨化蛋白-1、巨噬細胞炎性趨

22、化蛋白-1γ、肝細胞生長因子、白細胞介素10、間質金屬蛋白酶-2、干細胞因子和Fas蛋白配體。體外實驗：APAP誘導的體外肝細胞損傷提示，在APAP濃度為1.25mmol/L時，HSC-CM(5％)組細胞活性優(yōu)于HSC-CM(10％)組，分別為(86.17±4.84)％和(78.01±5.10)％，兩組間存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)；當APAP濃度達到5mmol/L時，三組細胞的活性相比，HSC-CM(5％)組細胞活性為(45.67±

23、2.23)％，分別優(yōu)于對照組的(42.33±2.58)％和HSC-CM(10％)組的(39.34±3.33)％，均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。在其他的APAP濃度時，三組間細胞活性相比均無統(tǒng)計學差異。將HSC-CM(5d)作為條件培養(yǎng)基與肝細胞培養(yǎng)后，BrdU摻合實驗提示對照組中BrdU陽性肝細胞數(shù)目為(34.40±13.23)/FOV，而HSC-CM(5d)組增多47.97％，為(50.90+17.10)/FOV，兩組相比存在統(tǒng)計

24、學差異(P<0.05)。進一步檢測細胞的代謝功能提示，對照組和HSC-CM(5d)組細胞上清液中Albumin的濃度分別為(4.35±1.33)μg/ml/d和(6.56±2.32)μg/ml/d，兩組間存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。對照組和HSC-CM(5d)組細胞上清液中Urea的濃度分別為(13.44±6.12)μg/ml/d和(23.74±8.84)μg/ml/d，兩組間存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。將HSC-CM(5d)作

25、為條件培養(yǎng)基與AHPC培養(yǎng)后，HSC-CM(5d)組和對照組細胞的克隆形成率分別為(29.18±3.71)％和(21.08±2.94)％，兩組間存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。BrdU摻合實驗提示對照組BrdU和Albumin雙陽性的細胞數(shù)目為(73.50±17.81)/FOV，而HSC-CM(5d)組增多66.12％，為(122.10±26.28)/FOV，兩組相比存在顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。進一步檢測細胞的代謝功能提示，HS

26、C-CM(5d)組細胞上清液中Albumin的濃度為(14.47±3.04)μg/ml/d，比對照組的(8.93±2.52)μg/ml/d提高62.04％，兩組間存在統(tǒng)計學差異(P<0.01)。HSC-CM(5d)組細胞上清液中Urea的濃度為(34.83±12.21)μg/ml/d，比對照組的(20.87.44±9.53)μg/ml/d提高66.89％，兩組間存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　結論：活化的HSCs通過旁分泌途

27、徑參與急性肝損傷再生修復過程；早期活化階段和完全活化階段的HSCs旁分泌因子在急性肝損傷再生修復中的作用存在差異；早期活化階段的HSCs旁分泌因子具有保護肝損傷和促進肝修復的作用，機制包括：抗肝細胞壞死/凋亡，促肝細胞/肝臟干細胞增殖，下調炎癥反應水平。
　　全文結論：
　　1.活化的HSCs具有減輕急性肝損傷；促進肝細胞/肝臟干細胞增殖的作用。
　　2.活化的HSCs通過旁分泌途徑發(fā)揮急性肝損傷的保護作用并促進肝臟再