α7N膽堿受體在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲遷移和EMT中的作用及信號(hào)途徑.pdf

1、煙堿型膽堿受體（nicotinic receptors,nAChR）廣泛分布于自主神經(jīng)節(jié)后和副交感神經(jīng)支配的效應(yīng)器官和組織，發(fā)揮極為重要的生理學(xué)功能和藥理學(xué)作用。隨著非神經(jīng)源性膽堿系統(tǒng)和“膽堿能抗炎通路”認(rèn)識(shí)的不斷發(fā)展，nAChR在細(xì)胞調(diào)控中的作用日益受到關(guān)注。nAChR的所有亞型中，α7 N膽堿受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR）在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中均有較高表達(dá)，而且

2、與尼古丁有高度親和力。尼古丁是煙草的主要成分之一，也是天然nAChR的激動(dòng)劑。因而進(jìn)一步闡明α7nAChR對(duì)肺癌細(xì)胞的調(diào)控及其相關(guān)信號(hào)通路將具有重要生物學(xué)和藥理學(xué)意義。
　　目前肺癌在全球的發(fā)病率和死亡率位居所有腫瘤前列。無(wú)論對(duì)于其發(fā)病因素還是死亡原因，吸煙都是其確定的高危因素，不僅能促使肺癌的發(fā)生，還在肺癌的惡變和轉(zhuǎn)移中起重要作用。業(yè)已證實(shí)，尼古丁可通過(guò)激動(dòng)nAChR參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞多種活動(dòng)包括增殖、存活、凋亡、遷移等，促使腫瘤

3、細(xì)胞（包括肺癌細(xì)胞）的上皮間質(zhì)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）過(guò)程。然而，具有與尼古丁有高親和力的α7nAChR在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的侵襲和EMT中的作用迄今未見(jiàn)明確報(bào)道，α7nAChR對(duì)尼古丁所致肺癌侵襲及EMT調(diào)控的細(xì)胞信號(hào)通路也尚未完全闡明。
　　本研究采用transwell熒光檢測(cè)、RT-PCR、Westernblot等技術(shù)研究了NSCLC中多種 nAChR亞型的表達(dá)

4、情況；同時(shí)，采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-ESI-MS/MS）的技術(shù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)NSCLC細(xì)胞是否存在自分泌內(nèi)源性乙酰膽堿作用。分析了激動(dòng)、阻斷或基因沉默α7nAChR所介導(dǎo)的尼古丁促NSCLC細(xì)胞侵襲作用；采用裸鼠接種技術(shù)研究α7nAChR對(duì)腫瘤的在體生長(zhǎng)和侵襲功能；采用激光共聚焦、細(xì)胞免疫熒光、基因沉默、細(xì)胞高內(nèi)涵等技術(shù)觀察激動(dòng)、阻斷或基因下調(diào)α7nAChR對(duì)細(xì)胞形態(tài)、蛋白表達(dá)等EMT特征的作用，以及細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)變與侵襲力

5、間的關(guān)系；采用Fluro4 AM鈣熒光探針、Westernblot檢測(cè)受體耦聯(lián)的鈣離子流信號(hào)變化以及受體依賴性細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　研究結(jié)果表明：
　　1.在屬于NSCLC的A549、H1299及PC9細(xì)胞中，α7nAChR高表達(dá)于A549和H1299細(xì)胞，PC9細(xì)胞上未見(jiàn)α7nAChR表達(dá)。A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測(cè)限以上未測(cè)到內(nèi)源性乙酰膽堿。
　　2.尼古丁能明顯增強(qiáng)A549、H1299細(xì)胞的遷移侵襲能力，該

6、作用能被α7nAChR特異性阻斷劑α-銀環(huán)蛇毒（α-BTX）或基因沉默α7nAChR后所逆轉(zhuǎn)。
　　3.尼古丁能使細(xì)胞發(fā)生EMT，促使其表型由上皮樣轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣細(xì)胞，同時(shí)使其胞漿內(nèi)上皮、間質(zhì)標(biāo)志蛋白的表達(dá)發(fā)生改變。這一作用與α7nAChR上調(diào)、細(xì)胞侵襲力改變相關(guān)；阻斷α7nAChR，能使細(xì)胞侵襲力及間質(zhì)蛋白Vimentin的表達(dá)發(fā)生劑量依賴性抑制，基因下調(diào)α7nAChR表達(dá)，尼古丁引起的細(xì)胞侵襲增強(qiáng)和EMT過(guò)程能明顯受到抑制。

7、r>　　4.將α7nAChR基因沉默的H1299細(xì)胞接種于裸鼠，再給予其尼古丁時(shí)，裸鼠體內(nèi)接種的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與侵襲受到明顯抑制。
　　5.細(xì)胞內(nèi)PI3-K/AKT及 Ras-Raf-MEK-ERK通路以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化介導(dǎo)了α7nAChR調(diào)控的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　上述研究揭示了α7nAChR的活性調(diào)節(jié)可介導(dǎo)NSCLC細(xì)胞的侵襲力變化，并依賴于對(duì)NSCLC細(xì)胞EMT過(guò)程及間質(zhì)蛋白表達(dá)量的調(diào)節(jié)；發(fā)現(xiàn)在NSCLC中α7n