非小細胞肺癌中相關(guān)microRNA的篩選及miR-191對A549肺腺癌細胞的遷移侵襲能力影響的研究.pdf

1、目的:現(xiàn)有研究表明miRNA在多種惡性腫瘤中存在不一樣水平的表達異常。本研究旨在探究非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中相關(guān)的miRNA，如miR-195、miR-145、miR-140-3p、miR-191、miR-126等是否存在表達異常，并選擇在NSCLC中存在表達異常的miRNA，分析其與患者臨床病理特性的關(guān)系及對患者總生存期的影響;通過體外實驗初步探究相關(guān)miRNA(miR-191

2、)對A549人肺腺癌細胞的遷移、侵襲等細胞功能的影響。
　　方法:第一部分查閱相關(guān)文獻，確定miR-195、miR-145、miR-140-3p、miR-191、miR-126等可能與NSCLC相關(guān)的microRNA作為研究對象。采用實時熒光相對定量聚合酶鏈式反應(yīng)(quantitative realtime polymerase chainreaction，qRT-PCR)技術(shù)檢測非小細胞肺癌患者的癌組織及癌旁組織中miRNA的表

3、達的差異性，初步分析各miRNA的表達量與非小細胞肺癌的相關(guān)性，根據(jù)分析結(jié)果初步篩選出可能與非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miRNA，根據(jù)篩選結(jié)果擴大樣本驗證初步篩選的結(jié)論，并收集標(biāo)本對應(yīng)患者的臨床病理特征資料及電話隨訪其生存情況，進一步分析所選miRNA與非小細胞肺癌的相關(guān)性。
　　第二部分憑據(jù)第一步篩選結(jié)果，我們確定miR-191為我們進一步研究的對象，采用瞬時轉(zhuǎn)染的方法將miRNA-NC、miR-191 inhibitor轉(zhuǎn)入

4、A549細胞中，并根據(jù)結(jié)果分為三組，空白組(Mock)、陰性對照組(NC)、實驗組(miR-191 inhibitor)，并對各組A549細胞進行一下研究:①劃痕實驗檢測各組細胞24h后的遷移能力的改變;②Transwell實驗檢測各組細胞的侵襲能力的改變。
　　結(jié)果:第一部分初步篩選中我們對34例NSCLC患者的腫瘤組織及對應(yīng)的癌旁組織進行RT-qPCR檢測后發(fā)現(xiàn)miR-195、miR-145、miR-140-3p等miRNA在

5、腫瘤組織中的表達量與癌旁組織的表達量無明顯改變(p＞0.05);而相對于腫瘤組織，miR-191、miR-126兩者表達量存在差異(p＜0.05)。增加檢測樣本后，我們發(fā)現(xiàn)其差別趨勢仍存在，相對于癌旁組織中的表達量，miR-191在腫瘤組織的表達上調(diào)(p＜0.05); miR-126在腫瘤組織中的表達下調(diào)（p＜0.05）。收集患者臨床病理特征資料，電話隨訪患者生存狀況進行統(tǒng)計學(xué)分析后發(fā)現(xiàn):在腫瘤組織分化程度較低的和（或）存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的

6、患者中miR-191的表達量升高更明顯(p＜0.05)，另外miR-191的表達量較高的患者較miR-191的表達量較低的患者的總生存期更短(p＜0.05);而在miR-126的臨床病理特征分析及患者總生存期的研究中并未發(fā)現(xiàn)這種不同(p＞0.05)。
　　第二部分通過組織RT-qPCR檢測及相關(guān)數(shù)據(jù)分析后，我們選擇miR-191作為我們的研究對象，采用瞬時轉(zhuǎn)染的方法順利將miRNA-NC、miR-191 inhibitor轉(zhuǎn)入A5

7、49細胞中，并根據(jù)結(jié)果分為三組，空白組(Mock組)、陰性對照組(NC組)、實驗組（miR-191 inhibitor組），分析實驗數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)相對于Mock組、NC組，實驗組的miR-191的表達量下調(diào)約98％，差異具有統(tǒng)計學(xué)差別（p＜0.05），而Mock組和NC組中miR-191的表達量無明顯的差異(p＞0.05)。成功沉默miR-191后，我們采用劃痕實驗檢測沉默后的A549細胞遷移能力的改變，與空白對照(Mock)及陰性對照(m

8、iR-NC)相比，沉默miR-191后A549細胞的劃痕愈合的距離顯著減小，劃痕愈合的時間顯著變長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。采用Transwell實驗檢測A549細胞的侵襲能力改變，發(fā)現(xiàn)相比與Mock組(124.00+6.56)、miR-NC組(123.00+9.95)，miR-191 inhibitor組(38.33+5.69)穿過半透膜的細胞數(shù)日明顯減少，細胞侵襲能力被削弱，差異含有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　

9、　結(jié)論:1、miRNA在非小細胞肺癌的發(fā)生及發(fā)展中扮演著重要的角色，其中miR-191在非小細胞肺癌患者中表達上調(diào)，與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者生存期有關(guān)，miR-191在組織分化程度較低者，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達量更高，且miR-191高表達者總生存期更短。而miR-126在非小細胞肺癌中表達成下調(diào)趨勢，并且它的表達量與患者的臨床病理特征及患者的總生存期無明顯的關(guān)系(p＞0.05)。
　　2、根據(jù)組織實驗的結(jié)果，我們選擇miR