IL-2和IL-7在調控調節(jié)性T細胞和記憶性T細胞的產生和功能中的新作用機制.pdf

1、第一部分新生小鼠調節(jié)性T細胞的“默認”產生機制
　　 目的：CD4+Foxp3+調節(jié)性T細胞(Treg)能廣譜抑制各種免疫反應。但Treg的產生機制，尤其是在新生小鼠免疫系統(tǒng)發(fā)育時的Treg產生機制尚不清楚。本課題擬研究在不同TCR刺激下新生小鼠T細胞轉化成Treg的潛力。
　　 方法：從新生或成年Foxp3/GFP小鼠胸腺或脾臟中分選CD4+Foxp3-T細胞，予不同的TCR刺激，3天后流式細胞儀檢測Foxp3/GFP

2、陽性細胞比例。為鑒定新生小鼠Treg，予CD3/CD28單抗刺激新生小鼠CD4+Foxp3-T細胞3天后應用流式細胞分選儀分選Foxp3/GFP陽性細胞(新生小鼠Treg)，并用流式細胞儀檢測新生小鼠Treg的表型和TCR再刺激時Foxp3表達的穩(wěn)定性。應用3H-胸腺嘧啶攝入法檢測新生小鼠Treg的體外抑制功能。體內實驗部分，將CD3單抗腹腔注射入新生或成年小鼠體內，或將新生或成年小鼠CD4+Foxp3-T細胞過繼輸注入Rag1-/-小

3、鼠體內，用流式細胞儀檢測Treg的產生。
　　 結果：在不同方式的TCR刺激下，在不添加外源性TGF-β和IL-2條件下，高達70％新生小鼠CD4+Foxp3-T細胞轉化成CD4+Foxp3+Treg，而在相同條件下，成年小鼠Treg轉化率低于10％。這些新生小鼠Treg具有抑制功能并相對穩(wěn)定地表達Foxp3。更重要的是，新生小鼠這種“默認”轉化成Treg的能力在出生后2周逐漸消失。與體外發(fā)現相符，腹腔注射CD3單抗刺激T細胞能

4、使新生小鼠Treg增加3倍，而不能顯著增加成年小鼠Treg數量。將新生或成年小鼠Foxp3-T細胞過繼輸注入Rag1-/-小鼠，12天后新生小鼠T細胞的體內Treg轉化率是成年小鼠的6倍。而令人意外的是，IL-7限制了體外新生小鼠Treg的產生。
　　 結論：綜上，在TCR刺激時，新生小鼠T細胞在無外源性IL-2和TGF-β條件下，內在地“默認”分化成Treg，而IL-7則可能限制了這種“默認”產生機制。
　　 第二部分

5、IL-2信號通路限制獲得性調節(jié)性T細胞前體細胞的形成但誘導其Foxp3的表達
　　 目的：胸腺來源的天然調節(jié)性T細胞(nTreg)產生的“兩步模型”概念已被接受。本研究將探討外周是否也存在獲得性調節(jié)性T細胞(iTreg)前體細胞，以及IL-2在形成這些前體細胞和誘導其Foxp3表達的作用。
　　 方法：為確定外周iTreg前體細胞的存在，分離、提純外周CD4+CD25+Foxp3-細胞，并予不同的細胞因子刺激，3天后用流

6、式細胞儀測定Foxp3表達。建立“兩步”培養(yǎng)法研究影響iTreg前體細胞產生的因素。在“兩步”中的“程序化”階段，予不同細胞因子、中和抗體或通路阻斷劑處理培養(yǎng)細胞。“程序化”處理3天后，在IL-2刺激下繼續(xù)培養(yǎng)3天(“Foxp3誘導”階段)，流式細胞儀檢測6天培養(yǎng)細胞的Foxp3表達。分選6天培養(yǎng)細胞中的Foxp3/GFP+細胞，流式細胞儀檢測該群細胞的表型和再刺激時Foxp3表達的穩(wěn)定性，體外和體內抑制功能分別通過3H-胸腺嘧啶攝入法

7、和易激性腸炎模型進行評估。
　　 結果：IL-2刺激CD4+CD25+Foxp3-脾臟細胞能產生超過10％Foxp3+iTreg，而其他γc依賴性細胞因子沒有類似效果。在CD4+T細胞接受TCR刺激的“程序化”階段，抑制IL-2-Jak3-Stat5信號通路能產生包含iTreg前體細胞的CD4+CD25+Foxp3-T細胞。而在“Foxp3誘導”階段，IL-2是誘導iTreg前體細胞表達Foxp3的最強細胞因子。在6天培養(yǎng)細胞中

8、，30-40％T細胞表達Foxp3，產生iTreg的數量是初始培養(yǎng)細胞的5倍以上。盡管在此模型中iTreg的產生不需要加入外源性的TGF-β，阻斷TGF-β信號通路顯著減少iTreg的產生?？趦刹侥Ｐ涂诋a生的iTreg在TCR再刺激時能穩(wěn)定表達Foxp3，并能在Rag1-/-小鼠中預防由CD4+CD45RBhighT細胞介導的易激性腸炎的產生。
　　 結論：IL-2-Jak3-Stat5信號通路負性調控iTreg前體細胞的產生，

9、但正性調控這些前體細胞表達Foxp3。
　　 第三部分 IL-2奪獲和TGF-β在CD4+CD25+調節(jié)性T細胞抑制CD4+CD25-T細胞活化中的協同作用
　　 目的：關于Treg抑制功能機制目前已有多種觀點，但這些機制間的相互作用尚未明確。本研究旨在探討其中兩個重要機制——IL-2奪獲與TGF-β在Treg抑制功能中的相互作用。
　　 方法：在圓底培養(yǎng)板或transwell系統(tǒng)進行的體外抑制試驗中，反應細胞(

10、Tconv)接受同基因抗原提呈細胞(APCs)和可溶性CD3單抗刺激，并與Treg共培養(yǎng)，予IL-2中和抗體、TGF-β或TGF-β中和抗體處理細胞。3天后用流式細胞儀檢測Tconv的活化、增殖和存活情況。在某些抑制試驗中，Tconv來自IL-2-/-小鼠或Bcl-2轉基因小鼠。
　　 結果：在體外抑制試驗中，組成性表達Bcl-2的Tconv(體外培養(yǎng)中具有抗凋亡特性)并不能逆轉Treg的抑制作用。而通過增加鈣內流、強化共刺激信

11、號或加入細胞因子等方式增強Tconv的活化能逆轉Treg的抑制作用。Treg不能抑制已活化的Tconv，而能抑制幼稚性T細胞活化標記性分子的表達，提示Treg是通過抑制Tconv的早期活化介導其抑制功能的。有趣的是，IL-2奪獲和TGF-β，這兩個Treg抑制機制，單獨作用并不能有效抑制Tconv的活化和增殖。而兩者聯合作用能產生類似于Treg的抑制功能。Transwell系統(tǒng)顯示兩者均參與了Treg的抑制功能。
　　 結論：T

12、reg的兩個抑制機制—IL-2奪獲和TGF-β聯合作用可能在有效抑制Tconv早期活化中發(fā)揮協同作用。
　　 第四部分 IL-7在活化期促進記憶性CD4+T細胞的產生
　　 目的：在T細胞活化期多個活化(抗原，共刺激分子和細胞因子)信號均影響后續(xù)記憶性T細胞(Tm)的產生。而IL-7受體不僅高表達于Tm，同時也高表達于幼稚性T細胞(Tn)，本研究將探討在Tn活化期IL-7刺激能否促進其存活并增加Tm的產生。
　　

13、 方法：予負載OVA323-339抗原肽的抗原提呈細胞(APCs)刺激OT-Ⅱ轉基因CD4+T細胞。在培養(yǎng)的最初兩天，IL-7或IL-7樣細胞因子TSLP添加到細胞培養(yǎng)中。6天后檢測培養(yǎng)細胞的活化、增殖和存活情況，并通過過繼輸注入B6-SJL小鼠以監(jiān)測Tm的產生。
　　 結果：在T細胞活化早期，IL-7或TSLP刺激并不顯著影響6天培養(yǎng)的CD4+T細胞的活化、增殖和葡萄糖攝入。然而，IL-7能顯著減少凋亡細胞的比例。過繼輸注6天