IL-21對HIV感染者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用研究.pdf

1、目的
　　 艾滋病(AIDS)又名獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquiredimmunedeficiencysyndrome),是由人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的一種嚴(yán)重傳染病。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highlyactiveantiretroviraltherapy,HAART)雖然能降低病毒載量,延緩HIV感染的疾病進(jìn)程,但治療后部分患者免疫重建不佳。如何有效恢復(fù)T細(xì)胞的功能,增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)的抗病毒能力,對于HIV感染免疫治療

2、及疫苗研究具有重要意義。
　　 白細(xì)胞介素-21(IL-21)是共用γ鏈(γc)細(xì)胞因子的新成員,在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。在HIV感染中,IL-21可顯著增加CD8+T細(xì)胞穿孔素及粒溶素等抗病毒功能,更重要的是,其發(fā)揮功能的同時,不加重機(jī)體的免疫激活,對增強(qiáng)抗HIV免疫應(yīng)答,抑制免疫活化及免疫重建具有重要意義,被認(rèn)為是有希望應(yīng)用到HIV感染臨床治療及疫苗佐劑研究的重要因子。IL-21的臨床治療發(fā)展的最大障礙,亦是決定因素,在于

3、IL-21所帶來的免疫效應(yīng)能否轉(zhuǎn)化為病死率和發(fā)病率的降低,能否改善疾病的轉(zhuǎn)歸。例如,在應(yīng)用IL-2治療HIV感染者的臨床實(shí)驗(yàn)中,盡管CD4+T細(xì)胞的數(shù)量顯著增加,但由于IL-2能擴(kuò)增Treg亞群,導(dǎo)致免疫功能受到抑制,患者存活率沒有改善。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryTcell,Treg)抑制免疫激活,也抑制免疫細(xì)胞功能,是免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子之一。細(xì)胞因子對Treg的影響在其應(yīng)用于HIV感染治療及疫苗中不可忽視,明確IL-21對

4、HIV感染者Treg的影響對其應(yīng)用具有重要意義。HIV感染中,IL-21對Treg的直接影響尚無報道,明確其對Treg的影響對其在HIV感染治療中的應(yīng)用具有重要意義。作為共用γc細(xì)胞因子家族的成員,IL-7及IL-15在腫瘤的臨床治療中發(fā)揮作用,亦應(yīng)用到HIV感染治療,但其對Treg的影響研究結(jié)果尚不一致。HIV感染中,IL-7及IL-15對Treg的直接影響尚無報道,IL-21對Treg影響與IL-2、IL-7及IL-15作用的差別亦

5、無報道。
　　 本研究對HIV感染者IL-21及Treg在疾病進(jìn)展中的變化進(jìn)行研究,并分析IL-21對Treg凋亡,增殖及其效應(yīng)分子CTLA-4和TGF-β的影響,與其它共用γc細(xì)胞因子作用對比,明確HIV感染者IL-21與Treg的相關(guān)性及IL-21等共用γc細(xì)胞因子對Treg的影響,為進(jìn)一步明確HIV的致病機(jī)制及艾滋病的免疫治療提供線索。
　　 方法
　　 1、研究對象
　　 58例無癥狀HIV慢性感

6、染者(HIV)均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診,感染途徑多為男男性接觸,感染時間一年以上,在檢測時間點(diǎn)均未接受HAART治療(檢測發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞數(shù)量低于350個/ul或出現(xiàn)艾滋病指征性疾病均接受治療)。25例健康對照為隨機(jī)抽取的HIV抗陰性、未暴露于HIV的健康人(NC),HIV及NC組年齡、性別經(jīng)檢驗(yàn)均無顯著性差異。本研究內(nèi)容獲得參加者的書面知情同意。
　　 2、Treg細(xì)胞比例、絕對值檢測
　　 兩管1×

7、106PBMC中加入anti-CD3-PerCP、anti-CD4-APC-CY7、anti-CD25-PE-CY7及anti-CD3-PerCP、anti-CD4-APC-CY7、anti-CD25-PE-CY7、anti-CD127-APC標(biāo)記的熒光抗體,冰上避光染色,洗滌細(xì)胞,前一管按Foxp3細(xì)胞破膜染色試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行細(xì)胞破膜、胞內(nèi)染色(anti-FoxP3-APC標(biāo)記的熒光抗體),洗滌并固定細(xì)胞。使用BDLSRⅡ流式細(xì)胞儀

8、及BDFACSDivaTM軟件檢測并分析Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例,計(jì)算其與該樣本的CD4+T細(xì)胞絕對值檢測結(jié)果的乘積即得到Treg細(xì)胞絕對數(shù)量。
　　 3、CD4+IL-21+T細(xì)胞檢測
　　 提取PBMC,與PMA、Ionomycin及GolgiStop共培養(yǎng)6小時。用PBS沈滌PBMC后,加anti-CD3-PerCP及anti-CD8-FITC,避光染色,用PBS洗滌后,細(xì)胞破膜,加anti-IL-21-

9、PE,避光染色,洗滌細(xì)胞后,固定細(xì)胞,FACSAria流式細(xì)胞儀Diva軟件進(jìn)行分析。以FSC、SSC、CD3-PerCP、CD8-FITC定義CD4+T細(xì)胞(CD3+CD8-T細(xì)胞),分析IL-21的表達(dá)。
　　 4、CD4+CD25+CD127low/-Treg及CD4+、CD8+T細(xì)胞增殖
　　 提取人PBMC,用2uMCFSE標(biāo)記PBMC,用重組IL-21、IL-2、IL-7、IL-15及anti-CD3刺激培養(yǎng)

10、5天,anti-CD3-PerCP、anti-CD4-APC-CY7、anti-CD25-PE-CY7、CD127-APC標(biāo)記的熒光抗體冰上避光染色,洗滌,流式檢測CD4+CD25+CD127low/-Treg及CD4+、CD8+T細(xì)胞增殖。
　　 5、CD4+CD25+CD127low/-Treg及CD4+/CD8+T細(xì)胞凋亡
　　 提取人PBMC,用重組IL-21、IL-2、IL-7、IL-15及anti-CD3刺激

11、培養(yǎng)3天,anti-CD3-APC-CY7、anti-CD4-FITC、anti-CD25-PE-CY7、CD127-APC標(biāo)記的熒光抗體冰上避光染色,洗滌,之后加入anti-AnnexinV-PE及anti-7-AAD,室溫避光染色,流式檢測CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞及CD4+/CD8+T細(xì)胞上AnnexinV及7-AAD的表達(dá)量,1h內(nèi)檢測完成。
　　 6、CD4+CD25+CD127low/-Tre

12、g上CTLA-4的表達(dá)
　　 提取人PBMC,用重組IL-21、IL-2、IL-7、IL-15及anti-CD3刺激培養(yǎng)3天,anti-CD3-PerCP、anti-CD4-APC-CY7、anti-CD25-PE-CY7、CD127-APC標(biāo)記的熒光抗體冰上避光染色,洗滌,細(xì)胞破膜,加anti-CTLA-4-PE,避光染色,洗滌細(xì)胞后,細(xì)胞固定,FACSAria流式細(xì)胞儀Diva軟件進(jìn)行分析。
　　 7、CD4+CD2

13、5+CD127low/-Treg的TGF-β分泌
　　 提取人PBMC,用重組IL-21、IL-2、IL-7、IL-15及anti-CD3刺激培養(yǎng)5天,于收獲前10小時加入Golgistop,收獲并染色,anti-CD3-PerCP、anti-CD4-APC-CY7、anti-CD25-PE-CY7、CD127-APC/PE標(biāo)記的熒光抗體冰上避光染色,沈滌,細(xì)胞破膜,分別加anti-TGF-β-PE,避光染色,洗滌細(xì)胞后,固定細(xì)

14、胞,FACSAria流式細(xì)胞儀Diva軟件進(jìn)行分析。
　　 8、CD4+T細(xì)胞絕對值及病毒載量檢測
　　 CD4絕對值依據(jù)1997年美國CDC關(guān)于HIV感染者CD4+T細(xì)胞檢測指導(dǎo)方法,應(yīng)用BD公司TruCOUNT管、FACSCalibur流式細(xì)胞儀MULTISET軟件檢測。病毒載量采用Roche公司COBAS(R)AmpliPrep(R)/COBAS(R)TaqMan(R)System自動載量儀上以實(shí)時熒光定量PCR方

15、法測定病毒載量。全部操作按照操作說明書進(jìn)行。檢測范圍為40-10E7拷貝/ml。
　　 9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以MeanwithSEM表示,兩組間實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的比較采用Mann-WhimeyU檢驗(yàn)兩組間的差異性,相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn),相關(guān)的兩組之間的比較用兩配對樣本檢驗(yàn)(Wilcoxon),P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 一、

16、HIV感染者CD4+IL-21+T細(xì)胞水平及其與Treg細(xì)胞相關(guān)性
　　 58.82%HIV感染者可檢測到CD4+IL-21+T細(xì)胞,41.18%HIV感染者未檢測到CD4+IL-21+T細(xì)胞。以病毒載量分組,發(fā)現(xiàn)HIV感染組中病毒載量低于20000拷貝/mL組CD4+IL-21+T細(xì)胞百分比(1.27±1.55%)及絕對值(5.30±7.81cells/ul)顯著高于病毒載量高于20000拷貝/mL組(P=0.021;P=0.

17、017)。未檢測到CD4+IL-21+T細(xì)胞的HIV感染者CD4+CD25+T細(xì)胞百分比顯著下降(P=0.020)。HIV感染者CD4+IL-21+T細(xì)胞百分比與CD4+CD25+T細(xì)胞百分比呈正相關(guān)(r=0.463,P=0.006),CD4+IL-21+T細(xì)胞絕對值亦與CD4+CD25+T細(xì)胞絕對值、CD4+CD25+CD127low/-Treg絕對值及CD4+CD25+Foxp3+Treg絕對值呈正相關(guān)(r=0.360,P=0.03

18、7;r=0.465,P=0.001;r=0.419,P=0.019)。
　　 二、IL-21等γc鏈細(xì)胞因子對Treg凋亡、增殖及效應(yīng)分子表達(dá)的影響
　　 我們首先研究了IL-21等γc鏈細(xì)胞因了對HIV感染者及健康對照Treg凋亡及增殖的影響。HIV感染者外周血PBMC在IL-21、IL-2、IL-7及IL-15作用下,Treg凋亡(annexinv+7-AAD+)百分比顯著低于未刺激對照(P=0.036;P=0.02

19、1;P=0.012;P=0.012);Treg增殖百分比顯著高于未刺激對照(P=0.041;P=0.002;P=0.006)。健康人外周血PBMC在IL-7和IL-15作用下,Treg凋亡(annexinv+7-AAD+)百分比顯著低于未刺激對照(P=0.028;P=0.046),Treg增殖百分比顯著高于未刺激對照(P=0.025;P=0.050)。我們發(fā)現(xiàn)IL-21、IL-2、IL-7及IL-15影響HIV感染者Treg凋亡及增殖的

20、變化有大于健康人Treg變化的趨勢,其中IL-2的作用達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)。
　　 我們又進(jìn)一步研究了IL-21等γc鏈細(xì)胞因子對Treg表達(dá)CTLA-4及TGF-β分泌的影響。HIV感染者外周血PBMC在IL-21,IL-2、IL-7及IL-15作用下,Treg的CTLA-4表達(dá)及TGF-β分泌有高于未刺激對照的趨勢,其中IL-21誘導(dǎo)Treg的CTLA-4表達(dá)顯著增加(P=0.011),IL-2和IL-15作用下

21、,Treg的TGF-β分泌顯著高于未刺激對照(P=0.007;P=0.005)。健康人外周血PBMC在IL-21、IL-7及IL-15作用下,Treg的CTLA-4表達(dá)顯著高于未刺激對照(P=0.046;P=0.046;P=0.028)。我們發(fā)現(xiàn)IL-21、IL-2、IL-7及IL-15誘導(dǎo)HIV感染者Treg的CTIA-4表達(dá)及TGF-β分泌的變化有大于健康人Treg效應(yīng)分子表達(dá)變化的趨勢,但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 三、IL-

22、21等γc鏈細(xì)胞因子對T細(xì)胞凋亡及增殖的影響
　　 IL-21等γc鏈細(xì)胞因子對CD4+T細(xì)胞凋亡及增殖的影響:HIV感染者外周血PBMC在IL-21、IL-7及IL-15作用下,CD4+T細(xì)胞凋亡(annexinv+7-AAD+)百分比顯著低于未刺激對照(P=0.011;P=0.017;P=0.017);在IL-7及IL-15作用下,CD4+T細(xì)胞增殖百分比顯著高于未刺激對照(P=0.001;P=0.011)。健康人外周血PB

23、MC在IL-7和IL-15作用下,CD4+T細(xì)胞增殖百分比顯著高于未刺激對照(P=0.003;P=0.004)。我們發(fā)現(xiàn)IL-21、IL-2、IL-7及IL-15抑制HIV感染者CD4+T細(xì)胞凋亡的變化有大于健康人CD4+T細(xì)胞凋亡變化的趨勢,其中IL-7及IL-21作用達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003;P=0.02);IL-21、IL-2、IL-7及IL-15誘導(dǎo)HIV感染者CD4+T細(xì)胞增殖的變化有低于健康人CD4+T細(xì)胞增殖變化的趨

24、勢,其中IL-2作用達(dá)到統(tǒng)汁學(xué)意義。(P=0.031)。
　　 IL-21等γc鏈細(xì)胞因子對CD8+T細(xì)胞凋亡及增殖的影響:HIV感染者外周血PBMC在IL-21、IL-2、IL-7及IL-15作用下,CD8+T細(xì)胞增殖百分比顯著高于未刺激對照(P=0.010;P=0.001;P=0.001;P=0.03);在IL-2l、IL-7及IL-15作用下,CD8+T細(xì)胞凋亡(annexinv+7-AAD+)百分比顯著低于未刺激對照(P

25、=0.012;P=0.012;P=0.012);健康人外周血PBMC在IL-21、IL-2、IL-7及IL-15作用下,CD8+T細(xì)胞增殖百分比顯著高于未刺激對照(P=0.005;P=0.003;P=0.003;P=0.037)。我們發(fā)現(xiàn)IL-21、IL-2、IL-7及IL-15抑制HIV感染者CD8+T細(xì)胞凋亡的變化有大于健康人CD8+T細(xì)胞凋亡變化的趨勢,其中IL-15及IL-21作用達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005;P=0.005)

26、;IL-21、IL-2、IL-7及IL-15誘導(dǎo)HIV感染者CD8+T細(xì)胞增殖的變化有低于健康人CD8+T細(xì)胞增殖變化的趨勢,其中IL-2、IL-7及IL-15作用達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019;P=0.011;P=0.033)。
　　 結(jié)論
　　 HIV感染者CD4+IL-21+T細(xì)胞與Treg細(xì)胞百分率及絕對值正相關(guān),IL-21促進(jìn)Treg存活及誘導(dǎo)Treg表達(dá)CTLA-4,但不促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖及TGF-β分泌。