HIV感染者NK細(xì)胞特異性應(yīng)答反應(yīng)研究.pdf

1、目的：自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cells，NK cells)是構(gòu)成先天性免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞，不需要預(yù)先刺激即可產(chǎn)生快速免疫應(yīng)答，是人體抵御腫瘤和病毒感染的第一道防線。但新的研究發(fā)現(xiàn)，通常被認(rèn)為是先天免疫細(xì)胞的NK細(xì)胞，也可以表現(xiàn)出適應(yīng)性免疫的某些特征，例如更有效的二次刺激反應(yīng)等功能，被認(rèn)為可能具有特異性免疫應(yīng)答，即免疫記憶功能。免疫記憶是針對(duì)二次免疫刺激，反應(yīng)更強(qiáng)烈的現(xiàn)象。O'learyJ G等第一次觀察到缺乏T細(xì)胞

2、和B細(xì)胞的小鼠可以針對(duì)各種不同的半抗原誘導(dǎo)接觸性超敏反應(yīng)，提出NK細(xì)胞可以介導(dǎo)第二次相同半抗原刺激的特異性記憶應(yīng)答;隨后Berrien-ElliottMM等發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞可通過(guò)IL-12、IL-15和IL-18預(yù)刺激產(chǎn)生活化，幾周以后再次用細(xì)胞因子刺激表現(xiàn)出增強(qiáng)的細(xì)胞功能，產(chǎn)生了免疫記憶反應(yīng);Dou Y等發(fā)現(xiàn)流感疫苗能夠在感染六個(gè)月內(nèi)引發(fā)NK細(xì)胞的記憶特性，并且NK細(xì)胞胞內(nèi)NKP46的表達(dá)發(fā)生顯著性增加，產(chǎn)生大量的IFN-γ; Reeve

3、s R K等在恒河猴中觀察到感染猴免疫缺陷病毒后，NK細(xì)胞表現(xiàn)出抗原特異性記憶反應(yīng)。人類免疫缺陷病毒感染人體后，是否存在NK細(xì)胞的免疫記憶現(xiàn)象，NK細(xì)胞表面受體的表達(dá)如何，至今尚無(wú)報(bào)道。本研究利用HIV感染者隊(duì)列，研究HIV感染者是否存在HIV特異性NK細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)，探索與特異性免疫應(yīng)答相關(guān)的NK細(xì)胞表面標(biāo)志，檢測(cè)HIV感染者隊(duì)列與NK細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答相關(guān)的受體表達(dá)情況，并分析NK特異性免疫應(yīng)答與HIV疾病進(jìn)展的關(guān)系。
　

4、　方法：⑴HIV感染者來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診，均為男性，感染的HIV病毒亞型以CRF01 AE為主;HIV抗體陰性的正常人均為男性。⑵提取外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入抗體CD3、CD14和CD19，陰選去除T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞，得到含有NK和DC的混合細(xì)胞群，加入刺激物HIV特異性蛋白GAG和ENV(2μg/ml)或者HIV特異性多肽Gag（2μg/ml），5％ CO2，37℃溫箱，孵育18h，檢測(cè)NK細(xì)胞IFN-γ分泌。

5、⑶NK和樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)的混合細(xì)胞群與刺激物共同孵育12h，加入GolgiStop再孵育6h收細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞表面染色CD3-Percp、CD56-PE-Cy7;用IFN-γ-APC進(jìn)行胞內(nèi)染色，加入200ul1％多聚甲醛溶液固定，使用流式細(xì)胞儀FACS LSRⅡ檢測(cè)IFN-γ，采用BD FACS DivaTM軟件進(jìn)行分析。⑷含有NK和DC細(xì)胞的混合細(xì)胞群，加入阻斷抗體NKG2A和NKG2C，1h后加入

6、刺激物HIV特異性蛋白GAG和ENV(2μg/ml)或者HIV特異性多肽Gag（2μg/ml），5％ CO2，37℃溫箱，孵育18h，檢測(cè)NK細(xì)胞IFN-γ分泌。⑸向100μl全血加入溶血素去除紅細(xì)胞，加CD3-Percp、CD56-PE-Cy7、CD57-PE、NKG2A-PE、NKG2C-APC表面染色，流式細(xì)胞儀FACS LSRⅡ檢測(cè)NKG2C、CD57和NKG2A的表達(dá)情況。⑹將20μl BD公司CD4-FITC、CD8-PE和

7、CD3-PerCP試劑加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中，逆向加樣法加入50μl混勻的抗凝全血，室溫避光15 min，加入1×免洗溶血素450μl，室溫避光15 min，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，MultiSET軟件分析結(jié)果，得到CD4+T淋巴細(xì)胞的絕對(duì)值。⑺應(yīng)用SPSS20.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示，兩組間實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的比較采用Mann—Whitney U檢驗(yàn)，三組間實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)

8、，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：①取HIV感染者和正常人外周血，經(jīng)過(guò)分離去除了T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞，得到含有NK和DC細(xì)胞的混合細(xì)胞群，分別加入HIV特異性蛋白GAG和ENV刺激18 h，檢測(cè)NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ，發(fā)現(xiàn)HIV感染者組NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ顯著高于正常人組(P=0.010)。②取HIV感染者和正常人外周血，經(jīng)過(guò)分離去除了T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞，得到含有N

9、K和DC細(xì)胞的混合細(xì)胞群，分別加入HIV特異性多肽Gag刺激18h，檢測(cè)NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ，發(fā)現(xiàn)HIV感染者組NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ顯著高于正常人組(P=0.029)。③取HIV感染者和正常人外周血，經(jīng)過(guò)分離去除了T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞，得到含有NK和DC的混合細(xì)胞群，分別加入PMA和離子霉素刺激18h，檢測(cè)NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ，發(fā)現(xiàn)HIV感染者組NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ和正常人組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。④取HIV特異性蛋白GA

10、G和ENV，分別刺激HIV感染者外周血NK細(xì)胞6h、12 h、18h和24 h，檢測(cè)NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的量，可知當(dāng)HIV特異性蛋白GAG和ENV刺激時(shí)間為18h，NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ明顯增多。⑤選取含有NK和DC細(xì)胞的混合細(xì)胞群，加入5μl NKG2A和NKG2C封閉抗體，再加入HIV特異性蛋白刺激18h，檢測(cè)NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ，發(fā)現(xiàn)加入NKG2A和NKG2C封閉抗體后，NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ比不使用NKG2C和NKG2A

11、抗體組有顯著性降低(P=0.003，P=0.011)。⑥選取HIV感染者外周血，經(jīng)過(guò)分離去除了T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞，得到含有NK和DC細(xì)胞的混合細(xì)胞群，分別加入不同濃度的NKG2A和NKG2C封閉抗體:0μg/μl、0.1μg/μl、0.5μg/μl和1.0μg/μl，再加入HIV特異性蛋白刺激18h，檢測(cè)NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ，發(fā)現(xiàn)加入1.0μg/μl NKG2A和NKG2C抗體時(shí)，抑制NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ效果好。⑦選取未治療

12、HIV感染者、治療HIV感染者和健康對(duì)照者，檢測(cè)外周血NK細(xì)胞NKG2C和NKG2A的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)未治療HIV感染者、治療HIV感染者外周血NKG2C+ NK細(xì)胞比正常人明顯增多(P=0.004，P=0.025)，而NKG2A+ NK細(xì)胞在三組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。⑧選取未治療HIV感染者、治療HIV感染者和正常人，檢測(cè)外周血NK細(xì)胞NKG2C和NKG2A分子，進(jìn)行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)未治療HIV感染者和治療HIV感染者外周血NKG2C+NKG2A-

13、NK細(xì)胞比正常人均明顯增高(P=0.030，P=0.024)，同時(shí)，未治療HIV感染者NKG2C+NKG2A+ NK細(xì)胞比正常人有明顯增高(P=0.002)。⑨檢測(cè)了HIV感染者外周血NK細(xì)胞表面NKG2A、NKG2C和CD57分子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HIV感染者外周血NKG2A+ NK細(xì)胞與CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)成正相關(guān)(P=0.045，r=0.442)，而NKG2C+ NK細(xì)胞、CD57+ NK細(xì)胞與CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。⑩

14、根據(jù)CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)高低將HIV感染者分為小于350細(xì)胞/微升和大于350細(xì)胞/微升兩組，研究發(fā)現(xiàn):CD4+ T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)大于350細(xì)胞/微升的HIV感染者外周血NKG2C+NKG2A+ NK細(xì)胞比CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)小于350細(xì)胞/微升的HIV感染者更高(P=0.043)，而NKG2C+CD57+ NK細(xì)胞在不同CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)分組比較中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：⑴HIV感染者外周血NK細(xì)胞具有特異性免疫應(yīng)答現(xiàn)象