HIV感染者slanDC介導ADCC效應(yīng)的研究.pdf

1、目的：樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是人體免疫系統(tǒng)中功能最強的一種專職抗原呈遞細胞(antigen presenting cells，APC)，能夠誘導天然免疫應(yīng)答，并在連接天然免疫和獲得性免疫中有重要的作用。傳統(tǒng)上，DC主要分為類漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cell，PDC)和髓樣樹突狀細胞(myeloid dendritic cell，MDC)兩個亞群。slanDC(6-sul

2、fo LacNAc，slan)是DC的新亞群，在抗感染和抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。已有報道，在清除HIV儲存庫的研究中，TLR7/8的激動劑R848發(fā)揮著一定作用，并作為HIV疫苗的佐劑，發(fā)揮抗病毒作用。研究顯示，正常人slanDC通過表達的CD16和CD32以及分泌的腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)發(fā)揮抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（antibody-dependent cell-me

3、diated cytotoxicity，ADCC）效應(yīng)，進而將靶細胞有效的裂解。在被HIV感染的細胞釋放出新病毒顆粒之前，相應(yīng)的效應(yīng)細胞可以發(fā)揮ADCC效應(yīng)將被感染的細胞裂解，從而抑制HIV的復制。HIV感染者體內(nèi)的NK細胞發(fā)揮的ADCC效應(yīng)與疾病進展呈負相關(guān)，并且可以阻斷HIV在母嬰間的傳播。本實驗室前期研究表明，感染HIV18天后，患者體內(nèi)的NK細胞即可發(fā)揮ADCC效應(yīng)，slanDC作為免疫系統(tǒng)的哨兵，在病原體入侵機體時首先發(fā)揮作用

4、，那么HIV感染者的slanDC是否可以發(fā)揮ADCC效應(yīng)以及Toll樣激動劑R848對該效應(yīng)是否有影響，目前尚未見報道。本課題以HIV感染未接受HAART治療者、接受HAART治療有效者為研究對象，通過體外構(gòu)建ADCC效應(yīng)模型，檢測HIV感染者slanDC體外發(fā)揮的ADCC效應(yīng)，探討R848對HIV感染者slanDC體外發(fā)揮ADCC效應(yīng)的影響，進一步闡明感染HIV后免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗病毒作用的機制，為尋找HIV免疫治療的新靶點提供依據(jù)。

5、r>　　方法：⑴選取HIV感染者共45例，45例HIV感染者均來自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診，經(jīng)免疫印跡試驗確認為陽性，根據(jù)是否接受高效抗病毒治療分為未治療組和治療組。健康對照組(healthy controls，HC)19例，均為HIV抗體陰性，血常規(guī)及肝腎功正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性，無免疫系統(tǒng)疾病，未暴露于HIV的正常人。納入本課題研究的所有患者均簽署了知情同意書，并通過了中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會

6、批準。⑵用密度梯度離心分離法提取樣本外周血單個核細胞(PBMC)，并計數(shù)。取3×106細胞檢測slanDC表面CD16/CD32，取6×106細胞檢測slanDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)。⑶體外ADCC效應(yīng)模型的構(gòu)建。以gp120抗原代替靶細胞，anti-gp120作為特異性抗體，兩者按比例混合放入37℃孵育1小時，形成抗原抗體復合物后，與PMMC共培養(yǎng)6小時。培養(yǎng)結(jié)束后，破膜，染slanDC胞內(nèi)分泌的TNF-α，用LSRⅡ流式細胞儀進行檢測

7、，BD FACSDivaTM軟件分析結(jié)果。⑷檢測培養(yǎng)前slanDC表面CD16、CD32。按照BD公司細胞表面染色說明書操作，用LSRⅡ流式細胞儀檢測slanDC表面CD16、CD32的表達。⑸slanDC發(fā)揮ADCC的檢測。共3組分別為實驗組、陽性對照組、空白對照組，依次加入gp120-anti-gp120復合物、R848、1640。培養(yǎng)6小時。培養(yǎng)結(jié)束后，染slanDC胞內(nèi)分泌的TNF-α，用LSRⅡ流式細胞儀進行檢測，BD FAC

8、SDivaTM軟件分析結(jié)果。⑹阻斷slanDC表面Fc段受體。在加入抗原抗體復合物前，加入CD16、CD32的阻斷抗體，混勻后，放入4℃冰箱孵育1小時。1小時后，加入gp120-anti-gp120復合物，混勻后培養(yǎng)6小時。培養(yǎng)結(jié)束后，破膜，染slanDC胞內(nèi)TNF-α，多聚甲醛固定后應(yīng)用LSRⅡ流式細胞儀進行檢測，BD FACSDivaTM軟件分析結(jié)果。⑺CD4+T細胞絕對值的檢測。應(yīng)用BD流式熒光抗體，F(xiàn)ACS Calibur流式細

9、胞儀及MultiSET軟件檢測并分析得到CD4+T淋巴細胞的絕對值。⑻HIV病毒載量測定。采用實時熒光定量PCR方法測定病毒載量。⑼統(tǒng)計學分析。應(yīng)用SPSS19.0和Graphpad5.0軟件包進行統(tǒng)計分析和圖形制作，全部數(shù)據(jù)用中位數(shù)表示，不同組間比較用非參數(shù)檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：①抗原抗體復合物介導正常人slanDC發(fā)揮ADCC效應(yīng)。加入gp120-anti-gp

10、120復合物后，slanDC分泌的TNF-α顯著高于只加gp120組、anti-gp120組(P＜0.05，P＜0.05)。②HIV感染者slanDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)。HIV感染未治療者slanDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)顯著低于健康對照和接受HAART治療者(P=0.0011，P=0.0002);隨治療時間延長，HIV感染者slanDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)逐漸恢復(P=0.0030，P=0.0043，P=0.0095); HIV感染者sla

11、nDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)與其表達的M-DC8呈負相關(guān)。③HIV感染者slanDC數(shù)量變化。HIV感染未治療者slanDC的數(shù)量顯著低于健康對照和接受HAART治療者(P=0.0331，P＜0.0001)，且隨著治療時間延長，slanDC數(shù)量顯著增加(P=0.0041，P=0.0042，P=0.0009); HIV感染者slanDC數(shù)量與其發(fā)揮的ADCC效應(yīng)呈正相關(guān)(P=0.0018);HIV感染未治療者slanDC數(shù)量與CD4+T細胞絕

12、對值呈正相關(guān)(P=0.0178)，與病毒載量呈負相關(guān)(P=0.0415)。④slanDC通過表達的CD16/CD32發(fā)揮ADCC效應(yīng)。同時阻斷CD16、CD32，slanDC分泌的TNF-α顯著降低(P＜0.05)。⑤slanDC表面CD16的表達。接受HAART治療的HIV感染者slanDC表達的CD16(MFI)顯著高于HIV感染未治療者和健康對照(P=0.0014，P=0.0003)，且HIV感染者slanDC表達的CD16(MF

13、I)與其發(fā)揮的ADCC效應(yīng)正相關(guān)(P＜0.0001);培養(yǎng)6小時后slanDC表達的CD16(MFI)顯著降低(P＜0.0001)。⑥slanDC表面CD32的表達。HIV感染者slanDC表達的CD32(MFI)與健康對照無顯著差異，與其發(fā)揮的ADCC效應(yīng)無相關(guān)性，培養(yǎng)前后表達無變化。⑦R848可恢復slanDC分泌TNF-α的能力。在R848刺激下，健康對照者、HIV感染未治療者、HAART治療者的slanDC分泌的TNF-α顯著增

14、高(P＜0.0001，P＜0.0001，P＜0.0001)，HIV感染未治療者slanDC分泌的TNF-α顯著高于健康對照者和接受HAART治療者(P=0.0332，P=0.0076)。⑧R848可顯著恢復HIV感染未治療者slanDC發(fā)揮ADCC的能力。加入R848后，HIV感染未治療者slanDC分泌的TNF-α顯著增加(P=0.0006)。⑨R848不能顯著恢復HIV感染治療者slanDC發(fā)揮ADCC的能力。加入R848后，HIV

15、感染治療者slanDC分泌的TNF-α無顯著變化(P=0.1649)。⑩HIV感染未治療者slanDC ADCC效應(yīng)的恢復顯著高于治療者。HIV感染未治療者slanDC的ADCC效應(yīng)的恢復水平顯著高于接受HAART治療者(P=0.0047)。
　　結(jié)論：⑴HIV感染接受HAART治療者slanDC數(shù)量顯著高于未治療者，隨治療時間延長，slanDC數(shù)量逐漸恢復，且HIV感染者slanDC數(shù)量與CD4+T細胞呈正相關(guān)，提示HAART治

16、療有助于HIV感染者slanDC數(shù)量的恢復。⑵HIV感染未治療者slanDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)顯著低于健康對照者和接受HAART治療者，但隨治療時間的延長，slanDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)逐漸恢復，提示HAART治療有助于HIV感染者slanDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)恢復。⑶HIV感染者slanDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)與其表達的CD16正相關(guān)，與slanDC數(shù)量正相關(guān)，提示HIV感染者slanDC的數(shù)量及表達的CD16可影響其發(fā)揮ADCC效應(yīng)。