一個(gè)新的MPL基因異常剪接體MPLL391-V392ins12的鑒定及在骨髓增殖性腫瘤中的突變分析.pdf

1、目的：
　　以不同方法對(duì)新發(fā)現(xiàn)的MPLL391-V392ins12異常剪接體進(jìn)行鑒定，以證實(shí)其真實(shí)存在性；在骨髓增殖性腫瘤（MPN）患者中分析其突變發(fā)生情況，并與JAK2V617F、MPLexon10、CALR突變的患者比較來(lái)探討其臨床意義。
　　方法：
　　1、MPLL391-V392ins12剪接體的鑒定
　　對(duì)目的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，擴(kuò)增MPL基因CDS序列，凝膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物，酶切

2、后連接到T-載體中，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂板，挑取菌落，堿性裂解法提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。針對(duì)剪接體的序列在不同位置設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，兩對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行掃描分析。
　　2、MPLL391-V392ins12剪接體在MPN中突變情況分析
　　收集MPN患者、正常人、其他血液腫瘤的骨髓或外周血標(biāo)本，以及實(shí)體瘤細(xì)胞株，提取基因組總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDN

3、A；對(duì)cDNA進(jìn)行等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)(AS-PCR)擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果分析，檢測(cè)其在PV、ET、PMF中的突變情況。收集僅攜帶單一突變 MPLL391-V392ins12、JAK2V617F、MPLexon10、CALR陽(yáng)性的ET、PMF患者的實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，分別兩兩進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析。
　　結(jié)果：
　　1、通過(guò)克隆測(cè)序，發(fā)現(xiàn)MPL基因存在一種新的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，即MPL基因的第7和8外顯子之間保留了36bp的

4、內(nèi)含子序列，導(dǎo)致蛋白編碼序列氨基酸位點(diǎn)391與392之間插入12個(gè)氨基酸（谷、甘、亮、賴(lài)、亮、亮、脯、丙、天冬、異亮、脯、纈），故命名為MPLL391-V392ins12。根據(jù)MPLL391-V392ins12剪接體的序列設(shè)計(jì)不同引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均得到該剪接體產(chǎn)物，說(shuō)明了MPLL391-V392ins12的真實(shí)存在性。
　　2、248例MPN患者中檢測(cè)到19例存在MPLL391-V392ins12突變(總突變率7.66％)

5、，其中PV1例,突變率1.92%(1/52)；ET14例,突變率9.66%(14/145)；PMF4例，突變率7.84%(4/51)；200例正常人群中未檢測(cè)到突變；71例CML患者中檢測(cè)到2例為陽(yáng)性，其余腫瘤中均未檢測(cè)到該剪接體。
　　3、MPLL391-V392ins1突變和MPLexon10突變的ET患者性別、年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)及血紅蛋白差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P值均>0.05）；MPLL391-V392ins12突

6、變的ET患者年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)低于JAK2V617F突變患者（P<0.05），血小板計(jì)數(shù)低于CALR突變患者（P<0.05）；MPLexon10突變的ET患者年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及血紅蛋白低于JAK2V617F突變患者（P<0.05），血紅蛋白低于CALR突變患者（P<0.05）；JAK2V617F突變的ET患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白高于CALR突變患者（ P<0.05）。MPLL391-V392ins12突變的 PMF患者年齡小于JAK2V6

7、17F突變患者（P<0.05）；JAK2V617F突變的PMF患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)高于CALR突變患者（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、本研究發(fā)現(xiàn)了MPL基因一個(gè)新的異常剪接體MPLL391-V392ins12，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，目前尚無(wú)報(bào)道。病例篩查進(jìn)一步證實(shí)MPLL391-V392ins12剪接體在三種經(jīng)典MPN中均可發(fā)生突變，且主要見(jiàn)于ET、PMF，可能是MPN發(fā)病的潛在原因之一。
　　2、ET患者中，MPLL391-