MPLA 497-L498ins4一個(gè)新突變基因?qū)aF3細(xì)胞增殖的作用研究.pdf

1、目的：
　　骨髓增殖性腫瘤（MPN）是一類以一系或多系髓系細(xì)胞包括紅系、粒系和巨核系增殖為主要特征的克隆性造血干細(xì)胞疾病。其中經(jīng)典的三類MPN疾病包括真性紅細(xì)胞增多癥（PV）、原發(fā)性血小板增多癥（ET）、原發(fā)性骨髓纖維化（PMF），其臨床表現(xiàn)較為相似且可以相互轉(zhuǎn)化。目前發(fā)現(xiàn)JAK2 V617F、JAK2 exon12、MPL exon10以及CALR exon9為MPN中PV、ET、PMF三種疾病的主要分子病因。我們前期通過(guò)對(duì)77

2、1例確診的MPN病人進(jìn)行上述基因篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)其中2例患者同時(shí)存在MPL基因的一種新突變類型（命名為MPL A497-L498ins4）。MPL基因編碼血小板生成素受體（TPOR）蛋白分子，TPOR的近跨膜區(qū)aa514-518無(wú)配體結(jié)合時(shí)可阻止受體二聚體相互靠近，進(jìn)而激活其下游如JAK2-STAT信號(hào)通路引起細(xì)胞增殖。以往研究報(bào)道的MPL基因突變類型主要為MPL W515點(diǎn)突變，并曾證實(shí)該突變可導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生自主促增殖能力，其機(jī)制可能是由于該

3、突變引起TPOR的aa514-518區(qū)域結(jié)構(gòu)異常進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞自主促增殖活性。MPL A497-L498ins4為插入4個(gè)氨基酸的突變，但并不在TPOR的aa514-518區(qū)域，那么該突變是否為引起患者M(jìn)PN發(fā)生的驅(qū)動(dòng)基因呢？為此本課題組擬通過(guò)慢病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)將該基因突變以及對(duì)照基因轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠原B淋巴細(xì)胞（BaF3）中，從細(xì)胞學(xué)水平探討該突變具有自主促細(xì)胞的作用。
　　方法：
　　1.構(gòu)建MPL A497-L498ins4及對(duì)

4、照基因的慢病毒表達(dá)載體
　　用RT-PCR法獲取MPL A497-L498ins4及對(duì)照基因MPL W515L、MPL WT的CDS區(qū)全長(zhǎng)，將PCR產(chǎn)物及慢病毒表達(dá)載體pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV（簡(jiǎn)寫為MSCV）通過(guò)雙酶切、酶切產(chǎn)物回收、連接反應(yīng)將上述目的基因插入到慢病毒表達(dá)載體中，并分別命名為MPL A497-L498ins4-MSCV（目的）、MPL W515L-MSCV（陽(yáng)性對(duì)照）、MPL WT-MSC

5、V（野生型對(duì)照）重組質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。
　　2.建立可穩(wěn)定表達(dá)MPL A497-L498ins4及各對(duì)照基因的BaF3細(xì)胞株
　　采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將各目的基因及包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)至293T包裝細(xì)胞中，獲得慢病毒顆粒后按最適比例感染BaF3細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分選GFP陽(yáng)性細(xì)胞，對(duì)分選后的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得可穩(wěn)定表達(dá)目的基因及各對(duì)照基因的BaF3細(xì)胞株。
　　3.比較分析MPL A497-L498ins4在無(wú)IL-3培養(yǎng)條件下對(duì)B

6、aF3細(xì)胞的增殖作用
　　正常情況下，BaF3細(xì)胞需要依賴鼠IL-3因子才能維持正常生長(zhǎng)。突變型MPL可使BaF3細(xì)胞不依賴IL-3自主增殖。因此本研究通過(guò)IL-3撤退實(shí)驗(yàn)觀察MPL A497-L498ins4對(duì)BaF3細(xì)胞增殖的影響，以此證實(shí)該突變體是否具有自主促細(xì)胞增殖的作用。設(shè)立MPL W515L-BaF3細(xì)胞、MPL WT-BaF3細(xì)胞、MSCV-BaF3細(xì)胞及BaF3細(xì)胞分別作為本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照、野生型對(duì)照、載體對(duì)照及空

7、白對(duì)照，所有各組均加無(wú)IL-3培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，收集0h、24h、48h、72h各時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞，采用CCK-8法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組中BaF3細(xì)胞增殖情況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　4.比較分析MPL A497-L498ins4對(duì)其配體TPO的敏感性
　　MPL基因編碼血小板生成素受體（TPOR），其配體為TPO。MPL基因突變可致TPOR不依賴配體TPO自主結(jié)構(gòu)性活化，因此突變型MPL在缺乏或低濃度TPO的情況下依然可引起細(xì)胞自我增殖，

8、而野生型MPL則必須依賴一定濃度的TPO刺激才能引起細(xì)胞增殖。因此本研究可通過(guò)檢測(cè)TPO敏感性實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)MPL A497-L498ins4突變是否具有自主促細(xì)胞增殖活性。分組同上，設(shè)立6個(gè)TPO不同濃度梯度（2ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/m、0.001ng/ml、0ng/ml）培養(yǎng)96h，采用CCK-8法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組中BaF3細(xì)胞增殖情況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1.各基因慢病毒表達(dá)載

9、體的構(gòu)建與鑒定
　　各基因MPL A497-L498ins4、MPL W515L、MPL WT成功連接到慢病毒表達(dá)載體pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中，經(jīng)一代測(cè)序法分別對(duì)插入載體的各基因進(jìn)行序列鑒定，Blast分析結(jié)果顯示各組載體插入基因序列均正確。
　　2.各基因慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)BaF3細(xì)胞模型的建立與鑒定
　　利用已構(gòu)建的表達(dá)載體，制備MPL A497-L498ins4及對(duì)照（陽(yáng)性對(duì)照MPL W515L

10、、野生型MPL WT、空載體MSCV）各基因慢病毒懸液并感染BaF3細(xì)胞株，流式檢測(cè)各組感染率依次為：82％、77%、70.5%、95.7%。應(yīng)用流式分選儀對(duì)小于90%GFP陽(yáng)性率的細(xì)胞進(jìn)行分選，最終使各組GFP陽(yáng)性率均呈90%以上。應(yīng)用RT-PCR方法及CD110-PE流式檢測(cè)方法分別鑒定各組細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的mRNA與蛋白表達(dá)情況：結(jié)果顯示除空載體MSCV組外其它各組均有目的基因表達(dá)，且各蛋白分子均定位于BaF3細(xì)胞膜上。所有結(jié)果提示成

11、功建立穩(wěn)定表達(dá)各基因的BaF3細(xì)胞模型。
　　3. MPL A497-L498ins4在無(wú)IL-3培養(yǎng)條件下對(duì)BaF3細(xì)胞的增殖能力分析
　　應(yīng)用CCK-8檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組BaF3細(xì)胞不依賴IL-3生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示：MPL WT組、MSCV組及BaF3組在各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖無(wú)顯著變化，且各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。MPL A497-L498ins4組與MPL W515L組在48h、72h細(xì)胞均出現(xiàn)明顯增殖，與MP

12、L WT、MSCV、BaF3三組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），但MPL A497-L498ins4組與MPL W515L組細(xì)胞增殖情況無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。4. MPL A497-L498ins4突變對(duì)其配體TPO敏感性分析
　　應(yīng)用CCK-8檢測(cè)各組BaF3細(xì)胞在TPO不同濃度下的增殖情況，結(jié)果顯示：在2ng/ml及1ng/ml TPO濃度時(shí)，MPL A497-L498ins4、MPL W515L、MPL WT三

13、組細(xì)胞均有明顯增殖，與MSCV、BaF3兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；在其余TPO濃度時(shí)，MPL WT、MSCV、BaF3三組無(wú)明顯增殖，而MPL A497-L498ins4、MPL W515L組細(xì)胞增殖較為顯著，且與其余三組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　MPL A497-L498ins4突變體可致BaF3細(xì)胞不依賴IL-3生長(zhǎng)，同時(shí)該突變體對(duì)低濃度TPO較野生型MPL敏感，提示該突變體具有