柑橘粉虱卵黃蛋白原基因RNAi載體構(gòu)建及對(duì)漸狹蠟蚧菌(Lecanicillium attenuatum)的轉(zhuǎn)化.pdf

1、柑橘粉虱（Dialeurodes citri Ashmaed）是世界性柑橘害蟲，常棲息于新梢葉片背面，并在上面產(chǎn)卵，在老葉和果實(shí)上很少出現(xiàn)。柑橘粉虱具刺吸式口器，喜歡刺吸柑橘汁液為食，導(dǎo)致葉片褪綠變黃，嚴(yán)重時(shí)引起落葉落果。更為重要的是，柑橘粉虱分泌的黏性蜜露，可吸附大量的灰塵于葉片上，并為一些霉菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，引發(fā)煤煙病，降低光合作用效率，影響果實(shí)的品質(zhì)。目前對(duì)粉虱的防治仍以化學(xué)防治為主，但化學(xué)防治往往又很容易導(dǎo)致環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、昆

2、蟲抗藥性和食品安全等一系列的問(wèn)題。
　　漸狹蠟蚧菌（Lecanicillium attenuatum）是蠟蚧菌屬中的一種重要昆蟲病原真菌，是控制柑橘粉虱的一種潛在生防因子。使用蠟蚧菌防治粉虱雖然有種種優(yōu)勢(shì)，但因其侵染周期長(zhǎng)、毒力低、且受諸多因素（如孢子或菌絲量、環(huán)境濕度和溫度等）的影響而導(dǎo)致防治效果不理想。卵黃蛋白原主要參與了昆蟲的發(fā)育和生殖等過(guò)程，并在產(chǎn)卵過(guò)程中起重要作用，因此，本試驗(yàn)嘗試通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建粉虱卵黃蛋白原基因的

3、RNAi載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（ATMT）將其轉(zhuǎn)入漸狹蠟蚧菌，再用該菌去侵染粉虱，以期該菌能通過(guò)釋放dsRNA來(lái)干擾粉虱卵黃蛋白的合成，阻斷粉虱發(fā)育時(shí)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而提高對(duì)粉虱的控制效果。本試驗(yàn)的主要研究結(jié)果如下：
　　1.絲狀真菌RNAi載體pRCy1的改造與構(gòu)建
　　以質(zhì)粒pRCy1為模板，擴(kuò)增目的Intron1和Intron2片段，長(zhǎng)度分別為200 bp和515 bp；利用Swa I和BamH I雙酶切pRCy1的

4、Intron，然后將兩個(gè)目的Intron連入質(zhì)粒pRCy1，另外一個(gè)載體pRCy1的Intron大小不變。接著擴(kuò)增目的EGFP片段，長(zhǎng)度為720bp；利用Pst I和Aat II雙酶切pRCy1的HygR，然后將EGFP連入質(zhì)粒pRCy1。再以質(zhì)粒pRCy1為模板，擴(kuò)增PtrpC+HygR片段，長(zhǎng)度為1389bp；利用Xmn I和Pst I雙酶切pRCy1的MAS terminator，然后將PtrpC+HygR連入質(zhì)粒pRCy1。至此

5、構(gòu)建成了含HygR+PtrpC+EGFP+PtrpC+PtrpC+Intron+TtrpC結(jié)構(gòu)的表達(dá)載體，將改造后的載體命名為pRCy2a、pRCy2b、pRCy2c。
　　2.柑橘粉虱卵黃蛋白原基因克隆及其RNAi載體的構(gòu)建
　　基于本實(shí)驗(yàn)室柑橘粉虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，并利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索昆蟲其他相關(guān)物種的卵黃蛋白原基因，然后對(duì)該基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析；再利用柑橘粉虱表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，找到上調(diào)倍數(shù)較高的卵黃蛋白原基因，并再使用NC

6、BI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行保守序列和功能性分析，篩選出所要干擾的目標(biāo)卵黃蛋白原基因，然后設(shè)計(jì)該基因的引物，以粉虱若蟲卵黃蛋白原cDNA為模板擴(kuò)增卵黃蛋白原基因。使用Xho I和Swa I雙酶切將三個(gè)載體pRCy2a、pRCy2b、pRCy2c都連上卵黃蛋白原基因的正向片段，使用Xba I和Sma I雙酶切同樣將卵黃蛋白原基因的反向片段連入已連有卵黃蛋白原基因正向片段的三個(gè)載體pRCy2a、pRCy2b、pRCy2c上。至此，構(gòu)建完成ihpRNA表達(dá)

7、盒。
　　3.農(nóng)桿菌AGL1介導(dǎo)的RNAi載體的轉(zhuǎn)化
　　將已經(jīng)構(gòu)建好的RNAi載體通過(guò)凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞AGL1，并通過(guò)ATMT將攜帶有潮霉素、EGFP、卵黃蛋白原正反序列和Intron結(jié)構(gòu)的T-DNA結(jié)構(gòu)整合到漸狹蠟蚧菌基因組中。然后再通過(guò)選擇培養(yǎng)基篩選、PCR鑒定和熒光顯微鏡觀察來(lái)驗(yàn)證漸狹蠟蚧菌陽(yáng)性假設(shè)子，綜合上述結(jié)果，本試驗(yàn)成功結(jié)果獲得了3種不同Intron長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)基因漸狹蠟蚧菌菌株。
　　4.對(duì)轉(zhuǎn)基因