金錢魚卵黃蛋白原基因克隆及EE2誘導(dǎo)卵黃蛋白原合成的研究.pdf

1、卵黃蛋白原（vitellogenin，Vtg）是卵黃蛋白的前體，通過下丘腦-垂體-性腺（hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG）軸激活雌激素受體來合成。卵生脊椎動(dòng)物的卵可以儲(chǔ)蓄大量的卵黃，卵黃的主要成分是被稱之為雌性成熟期血清蛋白的卵黃蛋白原。Vtg是合成卵黃過程中的關(guān)鍵性物質(zhì)，是魚類生殖過程中重要的生殖蛋白，在卵生動(dòng)物生殖和發(fā)育過程中起重要作用[1]。研究卵黃蛋白原的合成機(jī)制不但可以補(bǔ)充完善魚類生理學(xué)、發(fā)

2、育生物學(xué)等基礎(chǔ)研究，同時(shí)，掌握卵黃蛋白原體內(nèi)體外合成方式和機(jī)理，可以為魚類繁殖提供理論依據(jù)。
　　為更好地了解金錢魚（Scatophagus argus）卵黃蛋白原合成機(jī)制及能更精確地分析外源性雌激素對(duì)魚類合成卵黃蛋白原的影響，本文以金錢魚為研究對(duì)象，運(yùn)用基因克隆、熒光定量PCR和H.E.染色等方法，并從泄殖孔腹腔注射EE2（17α-ethynylestradiol）和體外EE2暴露肝原代細(xì)胞兩個(gè)角度對(duì)金錢魚在 EE2處理下的合成

3、規(guī)律做了進(jìn)一步的分析。本研究使用RACE克隆得到金錢魚金錢魚卵黃蛋白原基因的三種亞型的cDNA序列，金錢魚vtgAa的GenBank登錄號(hào)為KY676847，cDNA全長(zhǎng)5360 bp，開放閱讀框（ORF）為5091 bp，共編碼1696個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)金錢魚VtgAa蛋白分子量為186.07 ku，等電點(diǎn)為9.16，N端的前15個(gè)氨基酸為信號(hào)肽（圖1-3）。金錢魚vtgAb的GenBank登錄號(hào)為KY654346，cDNA全長(zhǎng)5346

4、bp，ORF為5100 bp，共編碼1699個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)金錢魚VtgAb蛋白分子量為186.37 ku，等電點(diǎn)為9.24，N端的前15個(gè)氨基酸為信號(hào)肽（圖1-3）。金錢魚vtgC的GenBank登錄號(hào)為KY676848，cDNA全長(zhǎng)4244 bp，ORF為3828 bp，共編碼1275個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)蛋白分子量142.87 ku，等電點(diǎn)6.43，信號(hào)肽為N端前15個(gè)氨基酸（圖1-3）。
　　根據(jù)H.E.染色的結(jié)果顯示：本實(shí)驗(yàn)所處理

5、的金錢魚皆處于性腺發(fā)育過程中的未成熟期，滿足 EE2注射實(shí)驗(yàn)的前提條件。因此推測(cè)注射后合成的卵黃蛋白原主要為注射 EE2的誘導(dǎo)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)使用灌流法從金錢魚肝臟組織上分離得到金錢魚肝細(xì)胞[2]（圖3-1），將分離得到的肝細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)至第三代后使用EE2暴露處理。
　　根據(jù)RT-qPCR分析結(jié)果顯示，在不同的采樣時(shí)間及不同劑量的EE2注射條件下，腹腔注射EE2的肝組織中vtgAb基因表達(dá)均高于其他兩種亞型，選取vtgAb作為 m

6、RNA表達(dá)水平檢測(cè)的主要基因（圖2-5）。根據(jù)注射EE2后肝組織中vtgAb的RT-qPCR結(jié)果顯示，vtgAb在EE2濃度為1.0μg/g和10.0μg/g處理時(shí)表達(dá)水平較高，而在濃度為0.01μg/g和0.1μg/g時(shí)表達(dá)水平較低（圖2-6）。在表達(dá)時(shí)間上：24h時(shí)vtgAb表達(dá)水平較低，48h時(shí)表達(dá)量逐漸升高并在72h達(dá)到最高，在96h時(shí)表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。金錢魚肝細(xì)胞內(nèi)vtgAb基因的表達(dá)量在EE2暴露濃度為10-8 mol/L、