五氯酚對稀有鮈鯽卵黃蛋白原和熱應(yīng)激蛋白誘導(dǎo)效應(yīng)的研究.pdf

1、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Environmental endocrine disruptors,EEDs)能夠通過干擾正常機體的內(nèi)分泌系統(tǒng)從而影響生物體生長、發(fā)育、繁殖等生命活動,已成為關(guān)系到人類生存和繁衍的熱點問題.五氯酚(Pentachlorophenol,PCP)屬于優(yōu)先檢測的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物之一.它作為一種高效廉價的殺蟲劑、木材防腐劑及除草劑曾在世界范圍內(nèi)廣泛使用.其在中國長江中下游11個省、市、自治區(qū)被大范圍、長時間地用作殺滅釘螺和控

2、制血吸蟲病,最終進入水體生態(tài)系統(tǒng)對水環(huán)境造成持久性污染.PCP具有較強的致癌、致畸、致突變作用,對生物體的生殖系統(tǒng)影響較大.PCP對生物體的內(nèi)分泌干擾作用日益明顯,但對其雌激素效應(yīng)一直存在異議,且PCP內(nèi)分泌干擾作用具體的分子機制及其可供檢測的敏感分子生物標志物研究均較少.稀有絢鯽為中國所特有的水生模式生物,與斑馬魚等相比具有更好的敏感性和實驗重復(fù)性,是進行化學(xué)品毒性測試和環(huán)境水樣毒性實驗的理想材料.因此,本研究選擇稀有鮈鯽為研究對象,

3、采用水體暴露的方式,分別從組織、蛋白、基因水平研究PCP對其卵黃蛋白原的誘導(dǎo)效應(yīng)以徹底揭示PCP的雌激素效應(yīng)及其作用機制;同時通過研究PCP對稀有鮈鯽熱應(yīng)激蛋白的誘導(dǎo)效應(yīng)以篩選敏感、準確的分子生物標志物,對PCP進行有效的監(jiān)測.研究內(nèi)容主要包括以下部分:
　　 1.為研究VTG在稀有鮈鯽不同組織器官的表達分布情況,以及PCP暴露對不同組織中VTG表達分布的誘導(dǎo)作用,采用半靜態(tài)水體暴露的方法,將成年雌、雄稀有鮈鯽及幼魚分別暴露于空

4、白對照組,DMSO溶劑對照組.16、80、160μg·L-1 PCP處理組,50 ng·L-1 EE2陽性對照組中14、21、28 d.先利用免疫組化法檢測空白對照組中稀有鮈鯽幼魚和雌、雄魚體內(nèi)肝臟、腎臟、脾臟、腸、性腺、大腦、肌肉組織中VTG蛋白的表達分布情況,研究發(fā)現(xiàn)VTG蛋白在稀有鮈鯽肝臟細胞中合成,通過血液循環(huán)到達其他組織;VTG蛋白只在稀有鮈鯽雌魚肝臟、腎臟、脾臟、腸組織中有分布,而在其幼魚和雄魚各組織中均未見分布.再利用免疫

5、組化檢測PCP和EE2暴露對稀有觴鯽幼魚和雄魚肝臟、腎臟、脾臟、腸、性腺、大腦、肌肉組織中VTG的誘導(dǎo)表達情況,研究發(fā)現(xiàn)PCP和EE2暴露均能誘導(dǎo)雄魚和幼魚肝臟、腎臟、脾臟、腸組織中出現(xiàn)VTG蛋白分布,但PCP效應(yīng)遠弱于EE2,并且其肝臟組織中VTG蛋白的分布與PCP暴露呈濃度效應(yīng)和時間效應(yīng).結(jié)果表明稀有鮈鯽幼魚及雄魚各組織中VTG的非正常表達分布可以應(yīng)用于環(huán)境雌激素的檢測,從組織水平驗證了PCP具有雌激素效應(yīng).
　　 2.采用

6、肝臟組織勻漿和收集血清兩種方法結(jié)合ELISA技術(shù)準確檢測不同濃度PCP暴露對雌雄稀有鮈鯽VTG蛋白的誘導(dǎo)量.研究發(fā)現(xiàn)40、80、120、160μg·L-1 PCP暴露21 d能夠顯著誘導(dǎo)雌雄稀有觴鯽肝臟和血清中VTG蛋白含量,并具有顯著濃度效應(yīng)(P＜0.01).結(jié)果表明稀有觴鯽肝臟組織勻漿結(jié)合ELISA方法同樣可以準確檢測PCP的雌激素效應(yīng).稀有鮈鯽VTG蛋白可以作為PCP檢測的分子生物標志物,從蛋白水平說明PCP具有雌激素效應(yīng).

7、>　　 3.為了解PCP雌激素作用的機制,利用Real-time PCR檢測8、16、80、160μg·L-1 PCP暴露21 d對稀有鮈鯽雄魚和幼魚肝臟中雌激素相關(guān)關(guān)鍵基因(Erα、ERB1、ERβ2、VTGⅠ、VTGⅡ)表達的影響.研究發(fā)現(xiàn),不同濃度PCP均能抑制稀有鮈鯽雄魚和幼魚肝臟中Erα基因mRNA的表達(P＜0.05),但誘導(dǎo)ERβ1、ERβ2基因mRNA的表達(P＜0.05);但EE2具有相反的作用,它誘導(dǎo)稀有鮈鯽雄魚和

8、幼魚肝臟中Erα基因mRNA的表達(P＜0.01),但抑制ERβ1、ERβ2基因mRNA的表達(P＜0.01).同時PCP和EE2都顯著誘導(dǎo)VTGⅠ、VTGⅡ基因mRNA的表達(P＜0.01),但PCP作用遠弱于EE2.說明PCP和EE2可能通過調(diào)節(jié)不同ER基因的表達,進而誘導(dǎo)VTG基因的表達發(fā)揮雌激素效應(yīng),從基因水平揭示PCP具有雌激素效應(yīng).
　　 4.利用簡并引物和RT-PCR技術(shù)從稀有鮈鯽肝臟中克隆得到HSP70和HSP9

9、0基因序列片段.HSP70基因片段為1783 bp,編碼594個氨基酸,提交Genbank得到序列號為:HQ897964;HSP90基因片段為1995 bp,編碼665個氨基酸,提交Genbank得到序列登錄號為:HQ897964.對稀有鮈鯽HSP70和HSP90基因氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)它們均具有高度保守性;建立系統(tǒng)進化樹,發(fā)現(xiàn)它們與金絲魚親緣關(guān)系最近.進行組織表達分析發(fā)現(xiàn)稀有鮈鯽HSP70在各組織中均有分布且在鰓和心臟組織中表達量最

10、高,而HSP90基因在除鰭以外組織都有分布,在肝臟組織中表達量最高.稀有鮈鯽HSP70和HSP90基因的克隆為其作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物暴露應(yīng)激的分子生物標志物研究奠定基礎(chǔ).
　　 5.利用Real-time PCR技術(shù)檢測不同濃度PCP暴露不同時間對稀有鮈鯽肝臟中HSP70和HSP90基因表達的影響.研究發(fā)現(xiàn)PCP可以顯著誘導(dǎo)稀有鮈鯽HSP70和HSP90基因mRNA的表達,并具有濃度效應(yīng)和時間效應(yīng).8、16、80、160μg·L

11、-1 PCP暴露7 d,HSP70基因誘導(dǎo)表達隨PCP濃度增加而增加,回歸方程為:y=0.0408x+1.6692;HSP90基因的誘導(dǎo)表達隨著PCP暴露濃度的增加先上升后下降,回歸方程為:y=-0.0002x2+0.0311x+1.1563.80μg·L-1 PCP暴露0.5、1、3、5、7 d,HSP70基因的誘導(dǎo)表達隨著PCP暴露時間的增加而增加,回歸方程為:y=0.721x+1.1606;HSP90基因的誘導(dǎo)表達隨著PCP暴露時